12.1: Мікроби та інструменти генної інженерії

Last updated
Save as PDF

Page ID: 4052

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Цілі навчання

Визначте інструменти молекулярної генетики, які походять від мікроорганізмів
Опишіть методи, що використовуються для створення рекомбінантних молекул ДНК
Опишіть методи, що застосовуються для введення ДНК в прокаріотичні клітини
Перерахуйте типи геномних бібліотек та опишіть їх використання
Опишіть методи, що застосовуються для введення ДНК в еукаріотичні клітини

Клінічна спрямованість: Частина 1

Кайла, 24-річний інженер-електрик і ентузіаст бігу, щойно переїхала з Арізони в Нью-Гемпшир, щоб влаштуватися на нову роботу. У вихідні дні вона любить досліджувати своє нове оточення, вирушаючи на довгі пробіжки в соснових лісах. У липні вона провела тиждень в походах по горах. На початку серпня у Кайли розвинулася низька температура, головний біль і легкі болі в м'язах, і вона відчула себе трохи втомою. Не думаючи про це, вона взяла трохи ібупрофену для боротьби зі своїми симптомами і пообіцяла більше відпочивати.

Вправа\(\PageIndex{1}\)

Які види медичних станів можуть бути причиною симптомів Кайли?

Наука про використання живих систем на благо людства називається біотехнологією. Технічно кажучи, одомашнення рослин і тварин за допомогою практики землеробства та селекції є різновидом біотехнології. Однак у сучасному розумінні ми пов'язуємо біотехнологію з безпосередньою зміною генетики організму для досягнення бажаних ознак через процес генної інженерії. Генна інженерія передбачає використання технології рекомбінантної ДНК, процесу, за допомогою якого послідовність ДНК маніпулюється in vitro, створюючи таким чином рекомбінантні молекули ДНК, які мають нові комбінації генетичного матеріалу. Потім рекомбінантна ДНК впроваджується в організм господаря. Якщо введена ДНК походить від іншого виду, організм господаря зараз вважається трансгенним.

Одним із прикладів трансгенного мікроорганізму є бактеріальний штам, який виробляє людський інсулін (рис.\(\PageIndex{1}\)). Ген інсуліну від людини був вставлений в плазміду. Потім ця рекомбінантна плазміда ДНК була введена в бактерії. В результаті ці трансгенні мікроби здатні виробляти і виділяти людський інсулін. Багато прокаріоти здатні купувати чужорідні ДНК і включати функціональні гени у власний геном шляхом «спаровування» з іншими клітинами (кон'югація), вірусної інфекції (трансдукції) та взяття ДНК з навколишнього середовища (трансформація). Нагадаємо, що ці механізми є прикладами горизонтального перенесення генів—перенесення генетичного матеріалу між клітинами одного покоління.

Діаграма, що пояснює технологію рекомбінантної ДНК. Ген інсуліну видаляється з ДНК в ядрі людської клітини. Потім цей ген вставляється в плазміду (круглий шматок ДНК). Результатом є рекомбінантна плазміда, яка потрапляє в бактеріальну клітину. Отримана трансгенна бактерія являє собою бактеріальну клітину з плазмідою, що містить ген інсуліну. Рекомбінантні бактерії діляться і виробляють білок, закодований для вставленого гена. У цьому прикладі бактерії виробляють і виділяють інсулін. В результаті виходить інсулін в розчині. — Малюнок\(\PageIndex{1}\): Рекомбінантна технологія ДНК - це штучна рекомбінація ДНК з двох організмів. У цьому прикладі ген інсуліну людини вставляється в бактеріальну плазміду. Потім цю рекомбінантну плазміду можна використовувати для перетворення бактерій, які отримують здатність виробляти білок інсуліну.

Молекулярне клонування

Герберт Боєр і Стенлі Коен вперше продемонстрували повний процес молекулярного клонування в 1973 році, коли вони успішно клонували гени від африканської пазучої жаби (Xenopus laevis) у бактеріальну плазміду, яка потім була введена в бактеріальний господар Escherichia coli. Молекулярне клонування - це набір методів, що використовуються для побудови рекомбінантної ДНК та включення її в організм господаря; він використовує ряд молекулярних інструментів, отриманих з мікроорганізмів.

Рестрикційні ферменти і лігази

У технології рекомбінантної ДНК молекулами ДНК маніпулюють за допомогою природних ферментів, отриманих в основному з бактерій і вірусів. Створення рекомбінантних молекул ДНК можливо завдяки використанню природних рестрикційних ендонуклеаз (рестрикційних ферментів), бактеріальних ферментів, що виробляються в якості захисного механізму для різання і знищення чужорідної цитоплазматичної ДНК, яка найчастіше є результатом бактеріофагової інфекції. Стюарт Лінн і Вернер Арбер виявили рестрикційні ферменти в своїх 1960-х дослідженнях того, як кишкова паличка обмежує реплікацію бактеріофагів на інфекції. Сьогодні ми широко використовуємо рестрикційні ферменти для різання фрагментів ДНК, які потім можуть бути зрощені в іншу молекулу ДНК, утворюючи рекомбінантні молекули. Кожен рестрикційний фермент розрізає ДНК на характерному місці розпізнавання, специфічну, зазвичай паліндромну, послідовність ДНК, як правило, від чотирьох до шести пар основ у довжині. Паліндром - це послідовність букв, яка читається так само вперед, як і назад. (Слово «рівень» є прикладом паліндрому.) Послідовності паліндромної ДНК містять ті ж базові послідовності в напрямку 5' до 3' на одній нитці, що і в напрямку 5' до 3' на додатковому нитку. Рестрикційний фермент розпізнає ДНК-паліндром і розрізає кожен кістяк в однакових положеннях в паліндромі. Деякі рестрикційні ферменти розрізають, щоб виробляти молекули, які мають додаткові звиси (липкі кінці), тоді як інші ріжуть, не утворюючи таких звісів, замість того, щоб виробляти тупі кінці (рис.\(\PageIndex{2}\)).

Молекули з додатковими липкими кінцями можуть легко відпалювати або утворювати водневі зв'язки між взаємодоповнюючими основами на своїх липких кінцях. Крок відпалу дозволяє гібридизувати одножильні звиси. Гібридизація відноситься до з'єднання між собою двох взаємодоповнюючих поодиноких ниток ДНК. Тупі кінці також можуть прикріплюватися разом, але менш ефективно, ніж липкі кінці через відсутність додаткових звисів, що полегшують процес. У будь-якому випадку лігазаза ДНК може потім знову приєднатися до двох цукрово-фосфатних кістках ДНК за допомогою ковалентного зв'язку, роблячи молекулу безперервною подвійною ниткою. У 1972 році Пол Берг, стенфордський біохімік, першим створив рекомбінантну молекулу ДНК за допомогою цієї методики, поєднавши вірус мавпи SV40 з бактеріофагом лямбда E. coli для створення гібриду.

Діаграми того, як рестрикційні ферменти розрізають ДНК. Обидві діаграми показують подвійні багатониткові шматки ДНК, які розрізаються. А) в липкому кінці різання ДНК розрізається так, щоб на місці розрізу були короткі однониткові шматочки ДНК. У цьому прикладі фермент скорочує послідовність GGATCC; він розрізає між двома G, Після різання обидві нитки мають подвійний багатожильний зв'язок G/C, але потім також мають одножильний GATC. У тупому торцевому різанні немає одножильних кінців. У цьому прикладі фермент скорочує GGCC між G і C. — Малюнок\(\PageIndex{2}\): (а) У цьому шестинуклеотидному рестрикційному ферменті сайті, розпізнаному ферментом *Bam* HI, зверніть увагу, що послідовність читається однаково в напрямку 5' до 3' на обох нитках. Це відоме як паліндром. Розрізання ДНК рестрикційним ферментом на ділянках (позначені чорними стрілками) виробляє фрагменти ДНК з липкими кінцями. Інший шматок ДНК, вирізаний тим же рестрикційним ферментом, міг прикріпитися до одного з цих липких кінців, утворюючи рекомбінантну молекулу ДНК. (b) Цей сайт розпізнавання чотирьох нуклеотидів також демонструє паліндромну послідовність. При розрізанні ДНК рестрикційним ферментом *Hae* III на зазначених ділянках утворюються фрагменти ДНК з тупими кінцями. Будь-який інший шматочок тупої ДНК міг прикріпитися до одного з тупих кінців, утворюючи рекомбінантну молекулу ДНК.

Плазміди

Після рестрикційного травлення гени, що представляють інтерес, зазвичай вставляються в плазміди, невеликі шматочки типово кругової дволанцюгової ДНК, які реплікуються незалежно від бактеріальної хромосоми (див. Унікальні характеристики прокаріотичних клітин). У технології рекомбінантної ДНК плазміди часто використовуються як вектори, молекули ДНК, які переносять фрагменти ДНК від одного організму до іншого. Плазміди, що використовуються як вектори, можуть бути генетично розроблені дослідниками та науковими компаніями-постачальниками, щоб мати спеціалізовані властивості, як показано широко використовуваним плазмідним вектором PuC19 (рис.\(\PageIndex{3}\)). Деякі плазмідні вектори містять гени, які надають стійкість до антибіотиків; ці гени резистентності дозволяють дослідникам легко знаходити колонії, що містять плазміди, шляхом нанесення їх на середовища, що містять відповідний антибіотик. Антибіотик вбиває всі клітини-господаря, які не містять бажаного плазмідного вектора, але ті, які містять вектор, здатні вижити і рости.

Плазмідні вектори, що використовуються для клонування, зазвичай мають сайт полілінкера або сайт багаторазового клонування (MCS). Сайт полілінкера - це коротка послідовність, що містить кілька унікальних сайтів розпізнавання рестрикційних ферментів, які використовуються для вставки ДНК в плазміду після рестрикційного перетравлення як ДНК, так і плазміди. Наявність цих місць розпізнавання множинних рестрикційних ферментів на сайті полілінкера робить плазмідний вектор універсальним, тому він може бути використаний для багатьох різних експериментів клонування, що включають різні ферменти рестрикції.

Цей сайт полілінкера часто зустрічається в гені репортера, іншої послідовності генів, штучно сконструйованих в плазміду, яка кодує білок, що дозволяє візуалізувати вставку ДНК. Ген репортера дозволяє досліднику відрізнити клітини-господаря, які містять рекомбінантні плазміди з клонованими фрагментами ДНК, від клітин господаря, які містять лише нерекомбінантний плазмідний вектор. Найбільш поширеним геном репортера, що використовується в плазмідних векторах, є бактеріальний ген LacZ, що кодує бета-галактозидазу, фермент, який природним чином розкладає лактозу, але також може деградувати безбарвний синтетичний аналог X-Gal, тим самим виробляючи сині колонії на X-Gal- містять середовищах. Ген репортера LacZ відключається, коли рекомбінантна ДНК зрощується в плазміду. Оскільки білок LacZ не виробляється при відключенні гена, X-Gal не деградується і утворюються білі колонії, які потім можна виділити. Цей метод синьо-білого скринінгу описаний далі і показаний на рис\(\PageIndex{4}\). На додаток до цих особливостей, деякі плазміди надходять попередньо перетравленими і з ферментом, пов'язаним з лінеаризованою плазмідою, щоб допомогти в лігації після введення чужорідних фрагментів ДНК.

Плазміда PC19 має довжину 2686 б.п. і є круговою. Є ряд стрілок різної довжини, що рухаються за годинниковою стрілкою або проти годинникової стрілки по колу. Коло має цифру 1 в самому верху і приблизно в позиції 225 (рухаючись за годинниковою стрілкою від 1) - сайт plylinker (MC), який містить наступні сайти рестрикційних ферментів: HiDiII, PSTI, SaII, xBai, BaMHi, SMAI, eCori. На початку сайту полілінкера знаходиться LACZ-альфа. У положенні 2500 і рухаючись проти годинникової стрілки знаходиться ген підсилювача. — Малюнок\(\PageIndex{3}\): Штучно побудований плазмідний вектор PuC19 зазвичай використовується для клонування чужорідної ДНК. Стрілки вказують напрямки, в яких відбувається транскрибування генів. Зверніть увагу на сайт полілінкера, що містить кілька унікальних сайтів розпізнавання рестрикційних ферментів, знайдених в гені репортера *LaCZ*. Також зверніть увагу на ген стійкості до ампіциліну (*амп*), закодований на плазміді.

Молекулярне клонування за допомогою трансформації

Найбільш часто використовуваним механізмом введення інженерних плазмід в бактеріальну клітину є трансформація, процес, в якому бактерії забирають вільну ДНК з оточення. У природі вільна ДНК зазвичай надходить з інших лізованих бактеріальних клітин; в лабораторії вільна ДНК у вигляді рекомбінантних плазмід вводиться в оточення клітини.

Деякі бактерії, такі як Bacillus spp., природно компетентні, тобто вони здатні займати чужорідні ДНК. Однак не всі бактерії від природи компетентні. У більшості випадків бактерії повинні бути зроблені штучно компетентними в лабораторії шляхом збільшення проникності клітинної мембрани. Цього можна досягти за допомогою хімічних обробок, які нейтралізують заряди на клітинній мембрані або шляхом впливу бактерій електричним полем, що створює мікроскопічні пори в клітинній мембрані. Ці методи дають хімічно компетентні або електрокомпетентні бактерії відповідно.

Після протоколу трансформації бактеріальні клітини наносяться на середовище, що містить антибіотики, щоб пригнічувати ріст багатьох клітин господаря, які не були перетворені плазмідою, що надає стійкість до антибіотиків. Метод, який називається синьо-білим скринінгом, потім використовується для плазмідних векторів LacZ, таких як PuC19. Сині колонії мають функціональний фермент бета-галактозидази, оскільки ген LacZ є безперервним, без сторонньої ДНК, вставленої в сайт полілінкера. Ці колонії, як правило, є результатом перевареної лінеаризованої плазміди, що перероджується до себе. Однак білим колоніям не вистачає функціонального ферменту бета-галактозидази, що свідчить про введення чужорідної ДНК в ділянку полілінкера плазмідного вектора, тим самим порушуючи ген LaCZ. Таким чином, білі колонії, отримані в результаті цього синьо-білого скринінгу, містять плазміди зі вставкою і можуть бути додатково скринінговані для характеристики чужорідної ДНК. Щоб бути впевненим, що правильна ДНК була включена в плазміду, потім можна секвенувати вставку ДНК.

Посилання на навчання

Переглянути анімацію молекулярного клонування з навчального центру ДНК.

Вправа\(\PageIndex{2}\)

У синьо-білому скринінгу, що означає синя колонія і чому вона синя?

Молекулярне клонування за допомогою кон'югації або трансдукції

Бактеріальний процес кон'югації (див. Як безстатеві прокаріоти досягають генетичної різноманітності) також можна маніпулювати для молекулярного клонування. F плазміди, або плазміди фертильності, переносяться між бактеріальними клітинами через процес кон'югації. Рекомбінантна ДНК може бути перенесена шляхом кон'югації, коли бактеріальні клітини, що містять рекомбінантну F плазміду, змішуються з сумісними бактеріальними клітинами, які не мають плазміди. F плазміди кодують структуру поверхні, яка називається F pilus, що полегшує контакт між клітиною, що містить F плазміду, і тією без F плазміди. При контакті між двома клітинами утворюється цитоплазматичний міст, а F-плазмидсодержащая клітина повторює свою плазміду, передаючи копію рекомбінантної F плазміди до реципієнтної клітини-реципієнта. Після того, як він отримав рекомбінантну F плазміду, реципієнт може виробляти власний F pilus і полегшити передачу рекомбінантної F плазміди в додаткову клітину. Використання кон'югації для перенесення рекомбінантних F плазмід в клітини-реципієнти є ще одним ефективним способом введення рекомбінантних молекул ДНК в клітини-господаря.

Крім того, бактеріофаги можуть бути використані для введення рекомбінантної ДНК в бактеріальні клітини господаря шляхом маніпуляції процесом трансдукції (див. Як безстатеві прокаріоти досягають генетичного різноманіття). У лабораторії цікаві фрагменти ДНК можуть бути сконструйовані у фагеміди, які є плазмідами, які мають послідовності фагів, які дозволяють упаковувати їх у бактеріофаги. Бактеріальні клітини потім можуть бути заражені цими бактеріофагами, щоб рекомбінантні фагеміди могли бути введені в бактеріальні клітини. Залежно від типу фага, рекомбінантна ДНК може бути інтегрована в бактеріальний геном господаря (лізогенез), або він може існувати у вигляді плазміди в цитоплазмі господаря.

Діаграма, що пояснює молекулярне клонування. І чужорідна ДНК, і плазміда розрізаються одним і тим же рестрикційним ферментом. Місце обмеження відбувається лише один раз в плазміді в середині гена для і ферменту (LaCZ). Плазміда також містить ген, стійкий до ампіциліну. Рестрикційний фермент залишає додаткові липкі кінці на чужорідному фрагменті ДНК і плазміді. Це дозволяє вставити чужорідну ДНК в плазміду, коли липкі кінці відпалюють. Додавання ДНК-лігази знову приєднує магістралі ДНК. Це рекомбінантні плазміди. Плазміди поєднуються з культурою живих бактерій. Багато бактерій не беруть жодних плазмід в свої клітини. Багато хто приймає плазміди, які не мають в собі чужорідної ДНК і деякі беруть на себе рекомбінантну плазміду. Бактерії, які займають рекомбінантну плазміду, не можуть зробити фермент з гена, в який був вставлений фрагмент (LacZ). Вони також несуть ген стійкості до антибіотика ампіциліну, який був на вихідній плазміді. Щоб знайти бактерії з рекомбінантною плазмідою, бактерії вирощують на пластині з антибіотиком ампіциліном та речовиною, яка змінює колір при впливі ферменту, що виробляється геном LaCZ. Ампіцилін вб'є будь-які бактерії, які не взялися за плазміду. Колір речовини не зміниться, коли ген для LaCZ містить чужорідну вставку ДНК. Це бактерії з рекомбінантною плазмідою, які ми хочемо виростити. — Малюнок\(\PageIndex{4}\): Кроки, що беруть участь у молекулярному клонуванні з використанням бактеріальної трансформації, викладені на цій графічній блок-схемі.

Вправа\(\PageIndex{2}\)

Яка початкова функція рестрикційного ферменту?
Які два процеси використовуються для отримання рекомбінантної ДНК в бактеріальну клітину-господаря?
Розрізняють використання гена резистентності до антибіотиків та гена репортера в плазмідному векторі.

Створення геномної бібліотеки

Молекулярне клонування також може використовуватися для створення геномної бібліотеки. Бібліотека являє собою повну (або майже повну) копію генома організму, що міститься у вигляді рекомбінантних плазмід ДНК, розроблених у унікальні клони бактерій. Наявність такої бібліотеки дозволяє досліднику створювати великі кількості кожного фрагмента шляхом вирощування бактеріального господаря для цього фрагмента. Ці фрагменти можуть бути використані для визначення послідовності ДНК і функції будь-яких присутніх генів.

Одним із способів генерації геномної бібліотеки є лігування індивідуальних рестрикційних ферментно-перетравлених геномних фрагментів на плазмідні вектори, розрізані тим же рестрикційним ферментом (рис.\(\PageIndex{5}\)). Після перетворення в бактеріального господаря кожна перетворена бактеріальна клітина займає одну рекомбінантну плазміду і виростає в колонію клітин. Всі клітини в цій колонії є ідентичними клонами і несуть одну і ту ж рекомбінантну плазміду. Отримана бібліотека являє собою сукупність колоній, кожна з яких містить фрагмент геному вихідного організму, які є окремими і окремими і можуть бути використані для подальшого вивчення. Це дає можливість дослідникам перевіряти ці різні клони, щоб виявити той, що містить цікавий ген з геному оригінального організму.

Діаграма, що показує генерацію геномної бібліотеки. Діаграма починається з того, що ДНК витягується з організму (в даному випадку хробака) і розрізається на фрагменти. Потім фрагменти ДНК вставляються в іншу плазміду. Це виробляє багато фрагментів, кожен з яких має різну вставку від генома. Потім бактерії трансформуються за допомогою цих переносників. Кожна бактерія відтворює виробляють колонії клонів, кожна з яких містить єдиний фрагмент ДНК з вихідного організму. — Малюнок\(\PageIndex{5}\): Генерація геномної бібліотеки сприяє відкриттю геномного фрагмента ДНК, який містить цікавить ген. (кредит «мікрофотографія»: модифікація роботи Національними інститутами охорони здоров'я)

Для побудови геномної бібліотеки з використанням більших фрагментів геномної ДНК в якості господаря може бути використаний бактеріофаг кишкової палички, такий як лямбда (рис.\(\PageIndex{6}\)). Геномна ДНК може бути стрижена або ферментативно перетравлена і перев'язана в попередньо перетравлений бактеріофаг лямбда-вектор ДНК. Потім ці рекомбінантні молекули ДНК фагів можуть бути упаковані в частинки фагів і використовуватися для інфікування клітин господаря кишкової палички на пластині. Під час зараження всередині кожної клітини кожен рекомбінантний фаг зробить багато копій себе і лизує газон кишкової палички, утворюючи наліт. Таким чином, кожна бляшка з бібліотеки фагів являє собою унікальний рекомбінантний фаг, що містить виразний геномний фрагмент ДНК. Потім бляшки можуть бути перевірені далі, щоб шукати гени, що цікавлять. Однією з переваг створення бібліотеки з використанням фагів замість плазмід є те, що частка фагів містить набагато більшу вставку чужорідної ДНК порівняно з плазмідним вектором, що вимагає набагато меншої кількості культур для повного представлення всього геному вихідного організму.

Діаграма, що показує виробництво бібліотеки фагів. Клітинний геном і геном фага перетравлюються одним і тим же рестрикційним ферментом. Клітинні фрагменти ДНК вбудовані в рекомбінантні фагові частинки (кожна частинка містить різний фрагмент клітинної ДНК). Потім кишкова паличка заражається рекомбінантними фагами. Кожен наліт на бактеріальному газоні містить фаги з унікальним фрагментом з вихідного генома. — Малюнок\(\PageIndex{6}\): Рекомбінантні молекули ДНК фагів виготовляються шляхом лігування перетравлених частинок фагів фрагментованими геномними молекулами ДНК. Ці рекомбінантні молекули ДНК фагів упаковуються в частинки фагів і дозволяють інфікувати бактеріальний газон. Кожна бляшка являє собою унікальну рекомбінантну молекулу ДНК, яку можна додатково обстежувати на предмет генів, що цікавлять.

Щоб зосередитись на експресованих генах в організмі або навіть тканині, дослідники будують бібліотеки, використовуючи РНК (мРНК) організму, а не геномну ДНК. Тоді як всі клітини в одному організмі матимуть однакову геномну ДНК, різні тканини експресують різні гени, виробляючи різні доповнення мРНК. Наприклад, геномна ДНК всіх клітин людини містить ген інсуліну, але тільки клітини підшлункової залози експресують мРНК, спрямовуючи вироблення інсуліну. Оскільки мРНК не можна клонувати безпосередньо, в лабораторії мРНК повинна використовуватися як шаблон ретровірусним ферментом зворотної транскриптази для створення комплементарної ДНК (кДНК). Повний доповнення мРНК клітини може бути зворотним транскрибуванням у молекули кДНК, які можуть бути використані як шаблон для ДНК-полімерази для створення дволанцюгових копій ДНК; ці фрагменти згодом можуть бути лігіровані або в плазмідні вектори, або бактеріофаг для створення бібліотеки кДНК. Користь бібліотеки кДНК полягає в тому, що вона містить ДНК тільки з експресованих генів в клітині. Це означає, що інтрони, контрольні послідовності, такі як промотори, і ДНК, не призначені для перекладу в білки, не представлені в бібліотеці. Зосередження уваги на перекладених послідовностях означає, що бібліотека не може бути використана для вивчення послідовності та структури генома в повному обсязі. Побудова геномної бібліотеки кДНК показано на малюнку\(\PageIndex{7}\).

Діаграма, що показує генерацію бібліотеки кДНК. Діаграма починається з того, що РНК витягується з організму (в даному випадку черв'як). Потім зворотна транскрипція використовується для перетворення РНК в кДНК. Потім фрагменти кДНК вставляються в іншу плазміду. Це виробляє багато фрагментів, кожен з яких має різну вставку від генома. Потім бактерії трансформуються за допомогою цих переносників. Кожна бактерія відтворює продукуючі колонії клонів, кожна з яких містить один фрагмент кДНК з вихідного організму. — Малюнок\(\PageIndex{7}\): Додаткова ДНК (кДНК) виготовляється з мРНК ретровірусним ферментом зворотної транскриптази, перетворюється в дволанцюгові копії та вставляється в плазмідні вектори або бактеріофаг, виробляючи бібліотеку кДНК. (кредит «мікрофотографія»: модифікація роботи Національними інститутами охорони здоров'я)

Вправа\(\PageIndex{3}\)

Які хости для описаних геномних бібліотек?
Що таке кДНК?

Введення рекомбінантних молекул в еукаріотичні хости

Використання бактеріальних хостів для генної інженерії заклало основу для технології рекомбінантної ДНК; однак дослідники також мали великий інтерес до генетично інженерних еукаріотичних клітин, особливо клітин рослин і тварин. Введення рекомбінантних молекул ДНК в еукаріотичних господарів називається трансфекцією. Генноінженерні рослини, звані трансгенними рослинами, представляють значний інтерес для сільськогосподарських і фармацевтичних цілей. Першим трансгенним рослиною, що продається в комерційних цілях, був помідор з затримкою дозрівання Flavr Savr, який вийшов на ринок у 1994 році. Також успішно виробляється генетично інженерна тваринництво, в результаті чого, наприклад, у свиней з підвищеною харчовою цінністю ¹ та кіз, які виділяють фармацевтичні продукти у своєму молоці. ²

Електропорація

Порівняно з бактеріальними клітинами, еукаріотичні клітини, як правило, менш піддаються як хости для рекомбінантних молекул ДНК. Оскільки еукаріоти, як правило, не компетентні брати чужорідні ДНК і не здатні підтримувати плазміди, трансфекція еукаріотичних господарів набагато складніша і вимагає більш нав'язливих методів для успіху. Один метод, який використовується для трансфекції клітин в культурі клітин, називається електропорацією. Короткий електричний імпульс індукує утворення перехідних пір в фосфоліпідних бішарах клітин, через які ген може бути введений. При цьому електричний імпульс генерує короткочасний позитивний заряд з одного боку внутрішньої частини клітини і негативний заряд з протилежного боку; різниця зарядів втягує в клітину негативно заряджені молекули ДНК (рис.\(\PageIndex{8}\)).

Діаграма, що показує електропорацію. Перша панель говорить: ввести ген в клітину. Показано клітину з виразною плазматичною мембраною, а зовні знаходиться рекомбінантна ДНК. Наступна панель говорить: застосовуємо електричний імпульс; в клітинній мембрані утворюються пори і ген потрапляє. На зображенні показані отвори в плазматичній мембрані. Позитивні заряди знаходяться всередині отворів, а негативні - зовні. Рекомбінантні шматочки ДНК переміщаються в клітину. Заключна панель говорить: після електричного імпульсу пори переущільнюються і ген залишається в клітині. На діаграмі знову показана безперервна плазмова мембрана і рекомбінантна ДНК як всередині, так і зовні клітини. Рекомбінантна ДНК всередині клітини позначається як «введений ген» — Малюнок\(\PageIndex{8}\): Електропорація - це одна лабораторна методика, яка використовується для введення ДНК в еукаріотичні клітини.

Мікроін'єкції

Альтернативний метод трансфекції називається мікроін'єкції. Оскільки еукаріотичні клітини, як правило, більші, ніж клітини прокаріотів, фрагменти ДНК іноді можуть бути безпосередньо введені в цитоплазму за допомогою скляної мікропіпетки, як показано на малюнку\(\PageIndex{9}\).

Мікрофотографія мікроін'єкційної голки, що тикає крізь плазматичну мембрану клітини і в ядро. — Малюнок\(\PageIndex{9}\): Мікроін'єкція - ще одна методика введення ДНК в еукаріотичні клітини. Мікроін'єкційна голка, що містить рекомбінантну ДНК, здатна проникати як в клітинну мембрану, так і в ядерну оболонку.

Генні гармати

Трансфекція рослинних клітин може бути навіть складніше, ніж клітини тварин через їх товстих клітинних стінок. Один підхід передбачає обробку рослинних клітин ферментами для видалення їх клітинних стінок, вироблення протопластів. Потім генна гармата використовується для відстрілу частинок золота або вольфраму, покритих рекомбінантними молекулами ДНК, в протопласти рослин з високою швидкістю. Потім клітини протопласту реципієнтів можуть відновлюватися і використовуватися для генерації нових трансгенних рослин (рис.\(\PageIndex{10}\)).

а) діаграма генної гармати. Ствол гармати вказує в бік заводу протопласт. Імпульс гелію проштовхує мікропроекції (частинки золота або вольфраму, покриті рекомбінантними молекулами ДНК) через стовбур і в рослинну клітину. б) фотографію генного пістолета; це розмір і форма фена, але з набагато більш вузьким отвором. — Малюнок\(\PageIndex{10}\): Частинки важких металів, покриті рекомбінантною ДНК, розстрілюють в протопласти рослин за допомогою генного пістолета. Отримані трансформовані клітини дозволяють відновлюватися і можуть бути використані для генерації рекомбінантних рослин. (а) Схема генної гармати. (б) Фотографія генної гармати. (Кредит а, б: модифікація роботи JA O'Brien, SC Lummis)

Шаттл Вектори

Інший метод трансфекції рослин включає човникові вектори, плазміди, які можуть переміщатися між бактеріальними і еукаріотичними клітинами. Пухлино-індукуючі (T _i) плазміди, що походять від бактерії Agrobacterium tumefaciens, зазвичай використовуються як човникові вектори для включення генів у рослини (рис.\(\PageIndex{11}\)). У природі T _i плазміди A. tumefaciens змушують рослини розвивати пухлини, коли вони переносяться з бактеріальних клітин в рослинні клітини. Дослідники змогли маніпулювати цими природними плазмідами, щоб видалити їх гени, що викликають пухлину, та вставити бажані фрагменти ДНК. Отримані рекомбінантні T _i плазміди можуть бути перенесені в геном рослини шляхом природного перенесення T _i плазмід від бактерії до господаря рослини. Потрапивши всередину клітини-господаря рослини, цікавий ген рекомбінується в геном рослинної клітини.

Діаграма трансформації рослинної клітини за допомогою плазміди Ti. Мікрофотографія стрижневих клітин з маркуванням Agrobacterium tumefaciens. З цих клітин виділяють плазміди. Плазміда (плазміда Ti) має область, позначену Т-ДНК. Цікавий ген з клітинної ДНК вставляється в область Т-ДНК. Трансформована рекомбінантна ДНК повертається назад до A. tumefaciens. Потім бактерія заражає рослинну клітину. Це вставляє цікавий ген і призводить до рекомбінантної рослини. — Малюнок\(\PageIndex{11}\): T _i плазміда *Agrobacterium tumefaciens* є корисним човником вектора для поглинання генів, що представляють інтерес, в рослинні клітини. Цікавий ген клонується в плазміду T _i, яка потім вводиться в рослинні клітини. Потім цікавий ген рекомбінується в геном рослинної клітини, дозволяючи виробляти трансгенні рослини.

Вірусні вектори

Вірусні вектори також можуть бути використані для трансфекції еукаріотичних клітин. Насправді цей метод часто використовується в генній терапії (див. Генна терапія) для введення здорових генів пацієнтам, які страждають захворюваннями, що виникають внаслідок генетичних мутацій. Вірусні гени можуть бути видалені і замінені геном, який буде доставлений пацієнту; ³ вірус потім заражає клітину-господаря і доставляє чужорідну ДНК в геном цільової клітини. Аденовіруси часто використовуються для цієї мети, оскільки вони можуть бути вирощені до високого титру і можуть заражати як нераділення, так і ділять клітини господаря. Однак використання вірусних векторів для генної терапії може становити певні ризики для пацієнтів, як обговорювалося в Генній терапії.

Вправа\(\PageIndex{4}\)

Які методи застосовуються для введення рекомбінантних векторів ДНК в клітини тварин?
Порівняйте і контрастуйте човникові вектори і вірусні вектори.

Ключові поняття та резюме

Біотехнологія - це наука про використання живих систем на благо людства. В останні роки здатність безпосередньо змінювати геном організму за допомогою генної інженерії стала можливою завдяки досягненням технології рекомбінантної ДНК, яка дозволяє дослідникам створювати рекомбінантні молекули ДНК з новими комбінаціями генетичний матеріал.
Молекулярне клонування включає методи, що використовуються для побудови рекомбінантної ДНК та полегшення їх реплікації в організмах-господаря Ці методи включають використання рестрикційних ферментів (для розрізання як чужорідних ДНК, так і плазмідних векторів), лігування (для склеювання фрагментів ДНК разом), а також введення рекомбінантної ДНК в організм господаря (часто бактерії).
Синьо-білий скринінг дозволяє відбирати бактеріальні трансформанти, які містять рекомбінантні плазміди з використанням фенотипу репортерного гена, який відключається вставкою фрагмента ДНК.
Геномні бібліотеки можуть бути зроблені шляхом клонування геномних фрагментів з одного організму в плазмідні вектори або в бактеріофаг.
Бібліотеки кДНК можуть бути створені для представлення молекул мРНК, експресованих в клітині в даній точці.
Трансфекція еукаріотичних господарів може бути досягнута різними методами з використанням електропорації, генних гармат, мікроін'єкцій, човникових векторів та вірусних векторів.

Виноски

1 Лянсюе Лай, Цзін Х. Кан, Жунфен Лі, Цзіндун Ван, Вільям Т. Вітт, Хван Юл Йонг, Яньхун Хао та ін. «Покоління клонованих трансгенних свиней, багатих омега-3 жирними кислотами». Природа Біотехнологія 24 № 4 (2006): 435—436.
2 Рейлен Рамос Моура, Лучана Магальяес Мело та Вісенте Хосе де Фігейредо Фрейтас. «Виробництво рекомбінантних білків у молоці трансгенних і нетрангенних кіз». Бразильський архів біології та технології 54 № 5 (2011): 927—938.
3 Вільям С.М., Ворд і Каролі Тот. «Аденовірусні вектори для генної терапії, вакцинації та генної терапії раку». Поточна генна терапія 13 № 6 (2013): 421.