17.5: Направлення руху білків у клітині

Кожен поліпептидний білок, перекладений рибосомами з послідовності основ в мРНК, має певне функціональне розташування, або в цитоплазмі, на клітинних мембранах, всередині органел або в позаклітинних рідинях. У цьому розділі розглянуто рух і сортування білків в ендомембранній системі, а також транспорт білків в органели і з них.

А. упаковка білків в RER

Весь синтез білка починається однаково, з утворенням комплексу ініціації і подальших циклів подовження утворення пептидних зв'язків і додавання карбоксилтермінальних амінокислот. Однак секреторні білки та ті, що призначені для лізосом, пероксисом або інших мікротіл, повне подовження безпосередньо в цистерни, або простори, укладені шорстким ендоплазматичним ретикулумом (RER). Можна виділити і очистити білки, що виділяються культивованими клітинами. Хорошою модельною системою для вивчення секреторного синтезу білка виявляються клітинами мишачої мієломи.

Клітини мишей мієломи були виділені і вирощені в культурі, де вони синтезують легкий ланцюг IgG, поліпептид, який входить до складу молекули імуноглобуліну миші. Імуноглобуліни збираються з легких і важких ланцюгових поліпептидів і виділяються в кровообіг. Там вони служать циркулюючими антитілами імунної системи хребетних. Мишачі мієломні клітини - це ракові клітини, які втратили здатність виробляти важкі ланцюгові поліпептиди. Натомість вони виділяють в основному легкий ланцюг IgG, що дозволяє легко очистити його від середовища культури клітин. Ранній експеримент показав, що секретовані поліпептиди, виготовлені в системі трансляції in vitro, більші (довше), ніж ті ж поліпептиди, виділені з рідин секреції. Цей експеримент узагальнено на наступній сторінці.

В одній частині описаного вище експерименту мієломні клітини вирощувалися в присутності радіоактивних амінокислот. Утворені радіоактивні поліпептиди легкого ланцюга IgG були виділені (слідують за червоними стрілками). мРНК, окремо витягнуту з іншої партії мієломних клітин, додавали в безклітинну систему трансляції, що містить радіоактивні амінокислоти. Радіоактивний поліпептид, синтезований in vivo та in vitro, розділяли на електрофоретичні гелі та авторентгенографували (слідуйте синім стрілкам, вище).

З авторадіографа зрілі, секретовані поліпептиди, зроблені in vivo, мігрували швидше на гель, ніж ті, що перекладені in vitro. Безклітинний продукт перекладу дійсно був більшим, ніж зрілий секретований поліпептид. Щоб пояснити ці результати, Гюнтер Блобель та його колеги запропонували гіпотезу сигналу, згідно з якою секреторні гени білка кодують додаткові амінокислоти як короткий амінотермінальний сигнальний пептид, який направляє зростаючий секреторний поліпептид на РЕР. Щоб пояснити меншу (тобто коротшу) довжину зрілого, секретованого поліпептиду, вони також запропонували, що сигнальний пептид є лише тимчасовим сигналом «трафіку», видаляється RER-асоційованим ферментом, коли поліпептид перетнув мембрану RER в цистернальний простір.

304 Формулювання гіпотези сигналу: ранні експерименти

У тесті гіпотези сигналу (який отримав Blobel Нобелівську премію 1999 року з фізіології або медицини) ізольовані мембрани RER були включені з мРНК клітин мієломи миші в системах синтезу безклітинних білків. Електрофоретичні авторентгенографи цього разу показали, що поліпептиди, виготовлені in vitro в присутності РЕР, були такого ж розміру, як і зрілі, що виділяються поліпептиди. Тому RER повинен містити технологічну активність, тобто сигнальну пептидазу, яка видаляє сигнальний пептид! Кроки сигнальної гіпотези, що виникла в результаті експериментів Блобеля та його колег, проілюстровані нижче.

Нагадаємо, що синтез будь-якого білка починається зі складання комплексу ініціації трансляції з подальшим поліпептидним подовженням. Під час подовження зростаючий поліпептид рухається наскрізь і виходить з каналу, або канавки у великій субодиниці. Коли з цієї канавки виходить N-кінцева послідовність сигналу (тобто сигнальний пептид) секреторного поліпептиду, вона взаємодіє з мембраною RER. Починаючи з нижнього лівого боку ілюстрації вище, етапи процесу:

1. SRP (частка розпізнавання сигналу) зв'язується з пептидом гідрофобного сигналу.
2. Подовження припиняється до тих пір, поки SRP-рибосомний комплекс не знайде мембрану RER.
3. Комплекс рибосоми-SRP зв'язується з рецептором SRP на мембрані RER.
4. SRP від'єднується від зростаючого поліпептидного ланцюга, підлягає переробці.
5. Подовження трансляції відновлюється через транслокаційний канал; сигнальна пептидаза в мембрані RER каталізує ко-трансляційний гідроліз сигнального пептиду, який залишається вбудованим в мембрану RER.
6. Подовження триває і зростаючий поліпептид починає складатися в РЕР.

305 Тестування гіпотези сигналу

306 Деталі гіпотези сигналу

Крок 2 вище вимагає, щоб SRP знаходив і зв'язувався з сигнальним пептидом до того, як зароджується поліпептид стане занадто довгим і почне складатися в 3D (третинну) конформацію. Виявляється, сама рибосома може зберегти пептид сигналу доступним шляхом дестабілізації електростатичних взаємодій, які в іншому випадку призведуть до згортання і, безсумнівно, неправильної конформації. Для отримання додаткової інформації про участь рибосом у згортанні білка, ознайомтеся з посиланням на Білок Folding-Destabilizing One Protein Strand в той час.

Секреторний механізм, тільки що описаний для еукаріотів має свого аналога в бактеріях, які виділяють білки, які допомагають в поглинаючи поживних речовин, а також синтез клітинної стінки. Частково витягнуті сигнальні пептиди направляють МРНК-зв'язані рибосоми на цитоплазматичну сторону плазматичної мембрани, де рибосоми зв'язуються, а потім пропускають подовжуючі білки через плазматичну мембрану в простір між клітинною мембраною і стінкою. У міру виходу білка з клітини бактеріальна сигнальна пептидаза (SpASe) розщеплює сигнальний пептид. Мабуть, механізм секреції білків розвивався рано і з тих пір зберігся. Як ми побачимо, цей механізм був додатково кооптований еукаріотами для упаковки білків в деякі органели та в самі мембрани. Деякі цікаві спекуляції щодо еволюції шляху упаковки білка обговорюються за посиланням нижче.

307 Напрямки білкового руху та еволюція шляхів

На початку ми виявили, що антибіотики зупиняють ріст бактерій або порушуючи клітинну стінку, або іншим чином вбиваючи клітини прямо. Тепер ми знаємо, що деякі антибіотики (наприклад, ариломіцини) порушують функцію спаази плазматичної мембрани, запобігаючи білкам, необхідним у просторі між клітинною стінкою та мембраною, коли-небудь виходити з клітини. Після використання проти ауреази стафілокока ариломіцини більше не ефективні, оскільки багато штамів стали стійкими до цих антибіотиків (натисніть Бактеріальний сигнал пептидази та стійкість до антибіотиків, щоб прочитати про механізм резистентності до ариломіцину). Як ви, можливо, вже знаєте, S. aurease зараз стійкий до багатьох антибіотиків, і хвороба від невиліковних інфекцій має свою назву, MRSA (метицилін-резистентний стафілокок Aurease - копати самостійно, щоб побачити більше про стійкість до метициліну). Хоча названий на метіциліну резистентність, MRSA тепер описує майже невиліковні S. aurease інфекції.

Б. синтез мембранно-охоплюючих (інтегральних) білків

N-термінальні послідовності сигналів також направляють рибосоми, що транслюють інтегральні мембранні білки в RER. Однак перед тим, як такий білок зможе повністю пройти через мембрану, послідовність стоп-переносу (гідрофобний домен всередині поліпептидного ланцюга) затримує білок в глибині жирної кислоти внутрішньої частини мембрани. Множинні послідовності стоп-трансферу складають трансмембранні білки, які охоплюють мембрану більше одного разу (нижче).

308 Інтегральні мембранні білки мають зупинку передачі послідовності

C. Переміщення та сортування упакованих білків до кінцевого пункту призначення

Як і білки, упаковані в RER, ті, що зроблені в цитоплазмі, йдуть в різні пункти призначення, перш ніж вони стануть функціональними. Давайте розглянемо механізми сортування білків, секвестрованих ендомембранною системою, і тих, що містяться в цитоплазмі.

1. Рух по ендомембранному шосе

Ми вже бачили, що після упаковки в цистерни RER білки починають посттрансляційну модифікацію (наприклад, «ядро глікозилювання»). Транспортні бульбашки, які відходять від RER, переносять упаковані та мембранні білки до цис-везикул апарату Гольджі. Там злиття везикул опосередковано розпізнаванням взаємодоповнюючих інтегральних мембранних білків, вбудованих в дві мембрани. Пізніше такі упаковані білки сортують до різних органел або до плазматичної мембрани. Сортування починається, коли білки рухаються з цис до транс-обличчя бульбашок Гольджі, де специфічні сортувальні білки асоціюються з різними упакованими білками в везикулах транс-Гольджі. Упаковані білки потім сортувати до везикул, які відходять від транс Гольджі стеки. Ці везикули рухаються до своїх кінцевих пунктів призначення, розпізнаючи і зливаючись з відповідними мембранами. Деякі події торгівлі білками анімовані на подіях в торгівлі білками і підсумовані на ілюстрації на наступній сторінці.

Джеймс Ротман, Ренді Шекман і Томас Зюдхоф виграли Нобелівську премію 2013 з фізіології або медицини за дослідження регулювання руху везикул (натисніть 2013 Нобелівську премію з фізіології або медицини для отримання додаткової інформації). Давайте простежимо за деякими білками всередині та на мембранах RER через клітину:

• Перехідні бульбашки, що несуть свою суміш упакованих білків, відходять від RER за допомогою білків оболонки COPI та COPII, і дисоціюють від рибосом, спочатку прикріплених до них. Перехідні бульбашки, однак, залишаються пов'язаними з білками КС.
• Ці везикули зливаються з бульбашками цис Гольджі, процес, також опосередкований білками КС. Білки COPI від'єднуються під час або після злиття, щоб бути перероблені назад в RER.
• Упаковані білки та мембранні білки додатково обробляються у міру проходження через стек бульбашок Гольджі, наприклад, піддаються термінальному глікозилюванню.

• На транс-обличчі бульбашок Гольджі білки вантажних рецепторів в мембранах зв'язують специфічні упаковані білки (тепер називаються білками вантажу). За допомогою клатрину та інших білків КС білки рецепторів вантажу, пов'язані з білками, відходять від стека транс-Гольджі. Однак цього разу конкретні вантажні білки сортують до окремих бульбашок з різними клітинними або позаклітинними напрямками. Ці бутонізуючі бульбашки також набувають мембранні V-SNARE (для везикул-пастки) білки.
• Коли білки V-SNARE на своїх везикулах зв'язуються з комплементарними білками T-SNARE (для Target-SNARE) на приймальних мембранах, мембрани зливаються.
  • Деякі везикули слідують цим шляхом, зливаючись з лізосомами або подібними бульбашками, щоб запасти їх відповідними ферментами та іншим вмістом білка. Білки оболонки відриваються від зростаючого бульбашки і переробляються, при цьому вміст бульбашок переноситься в наступну везикулу.
  • Везикули, що містять секреторні білки, зазвичай зливаються, утворюючи більші секреторні бульбашки. Секреторні бульбашки можуть зберігатися до тих пір, поки клітинам не подадуть сигнал про звільнення їх вмісту з клітини. У цей момент секреційні бульбашки зливаються з плазматичною мембраною, вивільняючи їх вміст у позаклітинну рідину. Ще раз білки оболонки і клатрін дисоціюють від секреторного бульбашки під час злиття.

Інші гравці були залишені поза цією дискусією, зокрема ті, які гідролізують нуклеотидні трифосфати, щоб забезпечити енергію для цього обігу білка. Крім того, ви можете розпізнати інших молекулярних гравців, таких як клатрин, які відіграють роль ендоцитозу, опосередкованого рецептором. Можливо, це не сюрприз! Адже ендоцитоз - це, принаймні частково, молекулярний трафік в протилежному напрямку утворення бульбашок і секреції.

2. Ядерний білок трафіку

Майже всі білки закодовані в ядрі і переводяться в цитозол. До них відноситься більшість тих, що знаходяться в самому ядрі, а також в мітохондріях і хлоропластах (див. Ендосимбіотична гіпотеза для опису експресії генів інтраорганел). Білки, синтезовані в цитозолі, призначеному для цих органел, містять олігопептидні світлофори, які направляють їх до відповідних пунктів призначення. Раніше ми бачили, що великі молекули (мРНК, ТРНК) і навіть цілі частинки (тобто рибосомні субодиниці) перетинають ядерну оболонку через ядерні пори.

Що стосується білків, що прямують до ядра, то сигнали ядерної локалізації, багаті позитивно зарядженими амінокислотами (лізин, пролін), дозволяють зв'язуватися з негативно зарядженим доменом білка рецептора ядерного транспорту в цитозолі. Цей процес проілюстрований нижче.

Коли комплекс двох білків наближається до ядерної пори, він взаємодіє з ядерними фібрилами пор, викликаючи відкриття пори. Потім два зв'язані білки перетинають подвійну мембрану ядерної оболонки, де вони накопичуються проти градієнта концентрації. Цей активний транспорт відбувається від гідролізу АТФ, коли ядерні білки потрапляють в ядро.

3. Мітохондріальний білок трафіку

Нагадаємо, що мітохондрії містять власний геном і поступальну техніку. Таким чином, вони транскрибують РНК і переводять власні білки. Однак гени в ядрі кодують багато білків, виявлених в мітохондріях. Імпорт цих білків в мітохондрії проілюстровано нижче.

На відміну від спільної поступальної упаковки білків RER, мітохондріальний перенесення білка є посттрансляційним. Це означає, що мітохондріальні білки, що утворилися в цитоплазмі, вже згорнулися, припускаючи третинну структуру. Однак складений білок викриває на своїй поверхні N-термінальний сигнальний пептид, який розпізнає і зв'язується з рецепторним білком на зовнішній мембрані мітохондрій. Білок рецептора охоплює як зовнішню мембрану мітохондрій (ОМ), так і кристалічну мембрану (СМ).

Білок рецептора доставляє білок до мембранних контактних білків, які також охоплюють обидві мітохондріальні мембрани. Мембранні контактні білки виконують роль каналу, або пори, через яку мітохондріальний білок перетинається в мітохондріальний матрикс.

Але є проблема: згорнутий білок не може перетнути мембрану сам по собі! Входження завершеного мітохондріального білка в цитоплазму вимагає так званого білка шаперону, в даному випадку білка HSP70 (тепловий шок 70). HSP70 контролює розгортання мітохондріального білка при його переході в матрикс. При видаленні сигнального пептиду мітохондріальною сигнальною пептидазою інша молекула HSP70, що мешкає в мітохондріоні, сприяє перегортанню білка в біологічно активну форму. Нагадаємо, що ГЕС спочатку були виявлені в теплі

309 Трафік білків до ядер і як вони спілкуються