15.5: Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)
- Page ID
- 6117
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) може ампліфікувати область ДНК з будь-якого джерела, навіть з ДНК однієї клітини або з фрагментів ДНК, отриманих з викопного. Це посилення зазвичай займає всього кілька годин, генеруючи мільйони копій потрібної цільової послідовності ДНК. Ефект полягає в очищенні ДНК від навколишніх послідовностей за одну реакцію! Карі Мулліс отримав Нобелівську премію в 1993 році за розробку ПЛР, яка зараз є основою незліченних досліджень структури, функції та еволюції генів, а також застосування в кримінальній криміналістиці, медичній діагностиці та інших комерційних цілях. ПЛР докладно описана нижче.
А. ПЛР - основний процес
Типова ПЛР спирається на знання двох бітів послідовності ДНК, які будуть використані для розробки та синтезу коротких олігонуклеотидних послідовностей (олігомерів) у лабораторії. Два олігомери обрані як доповнюють послідовності протилежних ниток дволанцюгової ДНК, що містить ген, який потрібно вивчати. Ми говоримо, що два олігомери стикаються, або протистоять один одному. Це просто означає, що 3' кінець одного олігомера стикається з 3' кінець протилежного олігомера. Таким чином, два олігомери можуть служити праймерами для реплікації подовження обох ниток подвійної багатониткової цільової послідовності ДНК. Перегляньте посилання нижче для подальшого пояснення.
272 ПЛР: розробка та синтез протилежних олігонуклеотидних праймерів
Першим кроком ПЛР є додавання олігомерних праймерів до цільової ДНК, з якої повинен бути ампліфікований ген (або інша геномна послідовність). Потім суміш нагрівають до денатурації цільової ДНК. Суміш охолоджують, щоб дати можливість праймерів H-зв'язатися з доповнюючими цільовими нитками ДНК. Далі чотири дезоксинуклеотидні попередники ДНК (DatP, DctP, dTTP і dGtP) додаються разом з невеликою кількістю ДНК-полімерази. Нові нитки ДНК тепер подовжуватимуться від олігонуклеотидних праймерів на шаблоні ДНК. Щоб зробити багато продукту ПЛР, цей цикл реакції потрібно повторювати багато разів. Тому, допустивши подовження, суміш нагрівають до денатури (відокремлюють) все нитки ДНК. Коли суміш знову охолоджується, олігомери знову знаходять взаємодоповнюючі послідовності, за допомогою яких відбувається H-зв'язок. Ранні версії ПЛР спочатку покладалися на ДНК-полімеразу кишкової палички, яка інактивується нагріванням, і тому довелося повторно додавати до суміші ПЛР для кожного циклу подовження. Так само, як і при секвенуванні ДНК, дослідники дуже швидко перейшли на термостійку полімеразу Taq Thermus aquaticus. Ферменти T. aquaticus залишаються активними при дуже високих температурах, при яких живуть ці організми. Оскільки нагрівання не руйнує полімеразу Taq in vitro, ПЛР, як і реакції секвенування ДНК, може бути автоматизована за допомогою програмованих термоцилерів, які підвищують та знижують температуру, необхідну реакціям ПЛР. Після початку циклів реакції більше не було необхідності заповнювати ДНК-полімеразу. Термоцилінг при типовій ампліфікації ПЛР показано нижче для перших двох циклів ПЛР, другий з яких виробляє перші нитки ДНК, які фактично будуть ампліфіковані експоненціально.
З ілюстрації видно, що другий цикл ПЛР породив дві нитки ДНК, які будуть шаблонами для подвоєння та повторного подвоєння бажаного продукту після кожного наступного циклу. Типова реакція ПЛР може включати 30 циклів ПЛР, що призводить до майже експоненціального посилення бажаної послідовності.
Виклик:
Починаючи з пари комплементарних молекул ДНК мішені (після 3-го циклу ПЛР), скільки подвійних багатониткових продуктів ПЛР ви теоретично повинні мати в кінці всіх 30 циклів ПЛР?
Ампліфіковані продукти продуктів ампліфікації ПЛР знаходяться в такій кількості, що їх можна легко побачити при флуоресцентному освітленні на гелі агарози, забарвленому бромідом етидію (нижче).
У цьому гелі перша смуга (зліва) містить драбину ДНК, суміш ДНК відомих довжин, які можуть бути використані для оцінки розмірів фрагментів ПЛР на 3-й і 4-й смугах (гелева смуга поруч зі сходами порожня). Дві яскраві смуги на смугах 3 та 4 - це продукти ПЛР, створені двома різними парами олігомерних праймерів. PCRAmplified DNA можуть бути секвеновані і використані в багатьох наступних дослідженнях.
B. Багато застосувань ПЛР
Продукти, що посилюються ПЛР, можуть бути марковані радіоактивними або флуоресцентними мітками, щоб служити зондами гібридизації для
- скринінг кДНК або геномних бібліотек і виділення клонів.
- визначення міграційної позиції на південному плямі.
- визначення міграційної позиції на північній плямі (химерна назва для РНК, які розділені за розміром на гелі і промазані для фільтрування).
- і багато іншого!
1. Кількісна ПЛР
Вище ми зазначили, що ПЛР має широке застосування в дослідженнях, медицині та інших практичних застосуваннях. Великим прогресом стала кількісна ПЛР, застосована до досліджень диференціальної експресії генів та регуляції генів. У Кількісній ПЛР початкові CDNA посилюються для виявлення не тільки присутності, але й відносної кількості специфічних стенограм, що складаються в клітині.
2. Криміналістика
Інше застосування ПЛР - в криміналістиці, щоб ідентифікувати людину або організм шляхом порівняння її ДНК з якимось стандартом або контрольною ДНК. Приклад одного з цих відбитків ДНК акриламідного гелю наведено нижче.
Використовуючи цю технологію, тепер можна виявити генетичні зв'язки між близькими та далекими родичами (а також виключити такі відносини), визначити батьківство, продемонструвати еволюційні зв'язки між організмами, а в багатьох випадках вирішувати нещодавні і навіть «холодні» злочини. Натисніть Сер Алек Джефріс, щоб дізнатися про походження ДНК відбитків пальців в реальному житті... і на всіх цих телевізійних програм CSI! Перевірте тут коротку історію народження відбитків пальців ДНК, і щоб побачити, як аналіз змін активності генів, які відбуваються після смерті, може навіть допомогти ідентифікувати злочинців. Для відео про відбитки пальців ДНК натисніть Alu і ДНК-дактилоскопік. Alu - це дуже повторювана послідовність ДНК ~ 300bp, виявлена у всьому геномі людини. Послідовності Alu - це короткі вкраплення елементів, або SINES, ретротранспозон, який ми бачили раніше. ДНК-дактилоскопія можлива частково тому, що кожен з нас має унікальну кількість і розподіл Alu SINE в нашому геномі. Щоб дізнатись більше про послідовності Alu та людську різноманітність, натисніть Послідовності Alu та людське різноманіття.
Інтригуючі приклади використання ПЛР для ідентифікації включають встановлення ідентичності єгипетських мумій, повалених і вбитих під час російської революції російського царя (разом з членами своєї сім'ї), а також недавно розкопаного тіла короля Річарда 3-го Англії. Протоколи та програми варіантів ПЛР різноманітні і часто досить винахідливі! Щоб отримати список, натисніть Варіації базової ПЛР.
3. Хто ваші предки?
Відстеження вашого етнічного, расового та регіонального походження пов'язане з відбитком пальців ДНК, оскільки воно спирається на ПЛР-ампліфікацію генів та інших областей ДНК та порівняння цих ваших послідовностей з розрізненням маркерів ДНК у великих базах даних послідовностей. Ціна на ці послуги зійшла вниз, і в результаті їх популярність в останні роки пішла вгору. Як правило, ви надаєте службі косу або слинний (буккальний) тампон, і вони підсилюють і послідовно ДНК у ваших зразках. Аналіз порівнює послідовності ДНК з послідовностями баз даних, шукаючи шаблони етнічних та регіональних маркерів, якими ви можете поділитися з базою даних. На основі цих порівнянь вам надається (більше... або менш) точна карта вашого походження на основі ДНК. Люди, які витрачають близько $100.00 (менше, коли продаються!) часто запитують, наскільки точні ці аналізи, і що вони насправді означають. Наприклад, що це означає, якщо ваша ДНК говорить, що ви 5% корінних американців? Насправді різні сервіси іноді можуть дати вам різні результати! Ви можете отримати деякі відповіді та пояснення DNA Ancestry Testing.