15.4: Геномні бібліотеки

Геномна бібліотека може бути трубкою, наповненою рекомбінантним бактеріофагом. Кожна молекула ДНК фага містить фрагментарну вставку клітинної ДНК з чужорідного організму. Бібліотека створена для того, щоб містити зображення всіх можливих фрагментів цього генома. Бактеріофаги часто використовуються для клонування фрагментів геномної ДНК, оскільки:

• геноми фагів більші за плазміди і можуть бути розроблені для видалення великої кількості ДНК, яка не потрібна для зараження та реплікації в бактеріальних клітинах-господарях.
• таким чином, відсутня ДНК може бути замінена чужорідними вставними фрагментами ДНК до тих пір, поки 18- 20kbp (пари кілобаз), майже 20X до тих пір, поки типові вставки кДНК в плазміди.
• очищені білки фагового покриву можуть бути змішані з рекомбінованою ДНК фагів, щоб зробити інфекційні частинки фагів, які заражають бактерії-господаря, відтворюють багато нових рекомбінантних фагів, а потім лізують клітини для вивільнення фага.

Необхідність таких векторів, як бактеріофаг, які можуть вмістити довгі вставки, стає очевидною з наступного біта математики. Типовий геном ссавців складається з більш ніж 2 мільярдів пар основ. Вставки в плазмідах дуже короткі, рідко перевищують 1000 пар основи. Розділивши 2 000 000 000 на 1000, ви отримуєте 2 мільйони, мінімальну кількість клонів фагів, які необхідно відсіяти, щоб знайти потрібну послідовність. Насправді вам знадобиться набагато більше, ніж ця кількість клонів, щоб знайти ген (або частини одного!). Звичайно, частиною вирішення цієї дилеми «голки в стозі сіна» є клонування більших вставок ДНК у більш пристосовані вектори.

З цього короткого опису ви можете визнати загальну стратегію генетичної інженерії клонуючого вектора: визначити мінімальні властивості, якими повинен володіти ваш вектор, і видалити несуттєві послідовності ДНК. Розглянемо штучну хромосому дріжджів (YAC), розміщені (репліковані в) дріжджові клітини. YACs можуть приймати величезні чужорідні вставки ДНК! Це тому, що для хромосоми, яка буде відтворюватися в дріжджовій клітині, потрібен один центромер і два теломери... і мало іншого!

Нагадаємо, що теломери потрібні в реплікації, щоб утримувати хромосому від укорочення під час реплікації ДНК. Центромер потрібен для приєднання хроматидів до волокон веретена, щоб вони могли відокремлюватися під час анафази при мітозі (і мейозі). Таким чином, поряд з центроміром і двома теломерами, просто включити місця обмеження, щоб включити рекомбінацію з вставками до 2000 Kbp. Це YAC! Важкою частиною, звичайно, є збереження фрагмента ДНК довжиною 2000 Кбіт/с досить довго, щоб отримати його в YAC.

Однак вектор розроблений та обраний, послідовність його вставки може розповісти нам багато речей. Вони можуть показати нам, як ген регулюється шляхом виявлення відомих і розкриття нових регуляторних послідовностей ДНК. Вони можуть сказати нам, які ще гени знаходяться поруч, і де гени знаходяться на хромосомах. Геномні послідовності ДНК одного виду можуть досліджувати подібні послідовності в інших видах, а порівняльний аналіз послідовностей може сказати нам багато про еволюцію генів та еволюцію видів.

Одним з ранніх сюрпризів від досліджень секвенування генів було те, що ми ділимося багатьма загальними генами та послідовностями ДНК з іншими видами, від дріжджів до черв'яків до мух... і, звичайно, хребетних і наших більш близьких друзів ссавців. Можливо, ви вже знаєте, що геноми шимпанзе та наші на 99% схожі. Більше того, ми вже бачили порівняльний аналіз послідовності, який показує, як білки з різними функціями все ж поділяють структурні домени.

Давайте розглянемо клонування геномної бібліотеки у фагах. Як ви побачите, принципи схожі на клонування чужорідної ДНК в плазміду або фактично будь-який інший вектор, але цифри і деталі, використовувані тут, є прикладом клонування в фаг.

Підготовка геномної ДНК певної довжини до клонування

Почнемо з того, що високомолекулярні (тобто довгі молекули) потрібної геномної ДНК виділяють, очищають і потім перетравлюють рестрикційним ферментом. Зазвичай дайджест є частковим, спрямований на генерацію перекриваються фрагментів ДНК випадкової довжини. Коли дайджест електрофорезується на агарозних гелів, ДНК (забарвлена бромідом етидію, флуоресцентним барвником, який зв'язується з ДНК) виглядає як яскравий мазок на гелі. Вся ДНК може бути рекомбінувана з відповідним чином перетравленої векторної ДНК. Але, щоб ще більше зменшити кількість клонів, що підлягають скринінгу для послідовності, що цікавить, ранні клонери генерували б Південний пляма (названий на честь Едварда Саузерна, винахідника методики) для визначення розміру фрагментів геномної ДНК, які, швидше за все, містять бажаний ген.

Починаючи з гелю геномних рестрикційних ДНК дайджестів, протокол Південного блота ілюструється нижче

Щоб підсумувати кроки:

а) Переварити геномну ДНК з однією або декількома рестрикційними ендонуклеазами.

б) Виконати продукти переварювання на агарозному гелі, щоб відокремити фрагменти за розміром (довжиною). ДНК з'являється у вигляді мазка при фарбуванні флуоресцентним барвником.

в) Помістіть фільтр на гель. ДНК переноситься (плями) на фільтр протягом, наприклад, 24 годин

г) Зніміть промокальний фільтр і помістіть його в мішок, що містить розчин, який може денатурувати ДНК.

д) Додайте радіоактивний зонд (наприклад, кДНК), що містить ген або послідовність, що цікавить. Зонд гібридизує (зв'язується) з комплементарними геномними послідовностями на фільтрі

f) Підготуйте авторадіограф фільтра і побачите «смугу», що представляє розмір геномних фрагментів ДНК, які включають послідовність, що цікавить.

Після того, як ви дізнаєтеся розмір (або діапазон розмірів) фрагментів рестрикції, які містять ДНК, яку ви хочете вивчити, ви готові:

а) запустити інший гель перетравленої геномної ДНК.

б) виріжте шматок гелю, що містить фрагменти, які «засвітилися» вашим зондом в авторадіографі.

в) видалити (елют) ДНК з гелевого шматка у відповідний буфер

г) підготувати ДНК до введення в (рекомбінацію з) геномний клонуючий вектор

Б. рекомбінування геномної ДНК з обмеженим розміром з ДНК фагів

Після елюції рестрикційних перетравлених фрагментів ДНК потрібного діапазону розмірів з гелів ДНК змішується з сумісно перетравленої ДНК фагів в концентраціях, що сприяють утворенню Н-зв'язків між кінцями фагової ДНК і геномними фрагментами. Додавання ДНК-лігази ковалентно пов'язує рекомбіновані молекули ДНК. Ці кроки скорочені на ілюстрації нижче.

Рекомбінантний фаг, який зроблений далі, буде містити послідовності, які стають геномною бібліотекою.

C. створення інфекційних вірусних частинок з рекомбінантною фаговою ДНК

Наступним кроком є упаковка рекомбінованої ДНК фагів з доданими очищеними білками вірусної оболонки, щоб зробити інфекційні фагові частинки (нижче)

269 Геномних бібліотек: зробити та упакувати рекомбінантну фагову ДНК

Упакований фаг додається в культуральну пробірку, наповнену бактеріями господаря (як правило, кишкова паличка) Після зараження рекомбінантна ДНК потрапляє в клітини, де вона реплікується і направляє виробництво нового фага, який в кінцевому підсумку лізує клітину-господаря (ілюстровано нижче).

Рекомбінований вектор також може бути введений безпосередньо в клітини-господаря шляхом трансдукції (яка полягає в фазі ДНК, що перетворення в плазмідну ДНК). Будь то шляхом інфекції чи трансдукції, рекомбінантна ДНК фагів потрапляє в клітини-господаря, які виробляють новий фаг, який врешті-решт лізує клітину-господаря. Вивільнені фаги продовжують заражати більше клітин господаря, поки всі клітини не лізували. Залишається трубка, повна лізату, що містить залишки клітин та багато рекомбінантних частинок фагу.

270 Заразити хоста рекомбінантним фагом, щоб зробити геномну бібліотеку

D. Примітка про деякі інші вектори

Ми бачили, що фагові вектори вміщують більші вставки чужорідних ДНК, ніж плазмідні вектори, і YAC ще більше..., і що для більших геномів мета полягає в тому, щоб вибрати вектор, здатний розмістити більші фрагменти «чужорідної» ДНК, щоб ви в кінцевому підсумку скринінгу менше клонів. З огляду на досить великий еукаріотичний геном, можливо, доведеться екранувати понад сто тисяч клонів у геномній бібліотеці на основі фагів. Окрім вибору розміру геномних фрагментів перед вставкою їх у вектор, не менш важливим є вибір відповідного вектора. У наведеній нижче таблиці наведено часто використовувані вектори та розміри вставок, які вони приймуть.

Тип вектора	Розмір вставки (тисячі основ)
Плазміди	до 15
Фаг Лямбда (\(\lambda \))	до 25
Косміди	до 45
Бактеріофаг Р1	від 70 до 100
P1 штучні хромосоми (ПАЦ)	від 130 до 150
Бактеріальні штучні хромосоми (БАК)	від 120 до 300
Дріжджі штучні хромосоми (YAC)	250 до 2000

Натисніть на посилання на ці вектори, щоб дізнатися більше про них. Ми продовжимо цей приклад шляхом скринінгу геномної бібліотеки фагового лізату на рекомбінантний фаг з цікавою геномною послідовністю.

Е. скринінг геномної бібліотеки; титрування рекомбінантних фагових клонів

Фаговий лізат титрують на бактеріальному газоні, щоб визначити, скільки вірусних частинок присутній. Бактеріальний газон виготовляється шляхом нанесення такої кількості бактерій на агарну пластину, що вони просто ростуть разом, а не як окремі колонії. При типовому титруванні лізат може бути розведений у 10 разів відповідним середовищем, і це розведення додатково розбавляється в 10 разів... і так далі. Такі серійні 10-кратні розведення потім поширюються на бактеріальні (наприклад, кишкова паличка) газони. Що відбувається на такій культурній тарілці?

Припустимо, коли 10 мкл одного з розведень поширюються на бактеріальному газоні, вони заражають 500 клітин кишкової палички на бактеріальному газоні. Через день або близько того на газоні з'являться невеликі галявини, які називаються бляшками..., 500 з них у цьому прикладі. Це 500 крихітних прозорих просторів на бактеріальному газоні, створених лізисом спочатку однієї зараженої клітини, а потім поступово все більше і більше клітин, що сусідять з початковою зараженою клітиною. Кожна бляшка, таким чином, є клоном одного вірусу, і кожна частинка вірусу в бляшці містить копію тієї ж рекомбінантної молекули ДНК фага (нижче).

Якщо ви насправді нарахували 500 бляшок на агарній пластині, то в 10 мкл, висіяних на газон, повинно бути 500 вірусних частинок. І, якщо ця пластина була четвертим розведенням в 10-кратному протоколі серійного розведення, повинно бути 2000 (4 X 500) частинок фагів в 10 мкл вихідного нерозведеного лізату.

Ф. скринінг геномної бібліотеки; зондування геномної бібліотеки

Для того, щоб представляти повну геномну бібліотеку, цілком ймовірно, що багато пластин такого розведення (~500 бляшок на пластину) доведеться створити, а потім просіяти на предмет бляшки, що містить цікавий ген. Але, якщо в фагові вектори були вставлені лише вибрані за розміром фрагменти, то бляшки представляють лише часткову геномну бібліотеку, що вимагає скринінгу меншої кількості клонів для пошуку послідовності, що цікавить. Для будь-якого виду бібліотеки наступним кроком є створення фільтрів реплік табличок. Репліка покриття бляшок схожа на виготовлення репліки фільтруючих бактеріальних колоній. Хоча значна частина ДНК фагів у бляшці укладена у вірусні білки, на репліках нальоту також буде ДНК, які ніколи не були упаковані у вірусні частинки. Фільтри можна обробити до денатурації останньої ДНК, а потім безпосередньо гібридизувати до зонда з відомою послідовністю. У перші дні клонування зонди для скринінгу геномної бібліотеки, як правило, були вже ізольованим і секвенованим кДНК клоном, або з того ж виду, що і геномна бібліотека, або з бібліотеки кДНК споріднених видів. Після замочування фільтрів в радіоактивно маркованому зонді рентгенівську плівку поміщають поверх фільтра, оголюють і розвивають. Чорні плями утворюватимуться там, де плівка лежить над бляшкою, що містить геномну ДНК, що доповнює радіоактивний зонд. У наведеному нижче прикладі для зондування геномної бібліотеки могли бути використані кДНК глобіну (гени глобіну були одними з перших, хто клонувався!).

Г. Виділення гена для подальшого вивчення

Клоновані фрагменти геномної ДНК набагато довші, ніж будь-який цікавий ген, і завжди довші, ніж будь-яка кДНК з бібліотеки кДНК. Вони також вбудовані в геном, який в тисячі разів перевищує сам ген, що робить вибір відповідного вектора необхідним. Якщо геном може бути скринінгований серед розумної кількості клонованих фагів (наприклад, ~ 100 000 бляшок), одна бляшка, що виробляє позитивний сигнал на авторадіографі, буде додатково вивчена.

Ця бляшка повинна містити цікавить ген. Наступним кроком є пошук гена в геномному клоні, який може бути довжиною до 20 кбіт. Традиційна стратегія полягає в очищенні клонованої ДНК, підлягаючи її рестрикційному перетравленню ендонуклеази, і відокремлення частинок травлення шляхом електрофорезу агарозного гелю. Використовуючи Southern Blotting, відокремлені фрагменти ДНК денатуруються і промокають до нейлонового фільтра. Потім фільтр прощупується за допомогою того ж тегового зонда, який використовується для пошуку позитивного клону (нальоту). Найменший фрагмент ДНК, що містить цікавить ген, може бути сам субклонований у відповідний вектор, і вирощений, щоб забезпечити достатню кількість ДНК для подальшого вивчення гена.

271 Зніміть геномну бібліотеку, вибирайте та вирощуйте клон фагів