15.3: Секвенування ДНК

Last updated
Save as PDF

Page ID: 6096

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Коротка історія секвенування ДНК

Секвенування РНК було першим, коли Роберт Холлі секвенував тРНК в 1965 році. Пряме секвенування тРНК було можливим, оскільки тРНК - це невеликі короткі нуклеїнові кислоти, і тому, що багато основ в ТРНК хімічно модифіковані після транскрипції. Ранній метод секвенування ДНК, розроблений Уолтером Гілбертом та його колегами, включав фрагментацію ДНК, секвенування дрібних фрагментів ДНК, а потім вирівнювання перекриваються послідовностей коротких фрагментів для складання довших послідовностей. Інший метод, метод секвенування ДНК на основі синтезу ДНК «дідеоксі», був розроблений Фредеріком Сангером в Англії. Сангер і Гілберт обидва отримали Нобелівську премію з хімії в 1983 році за свої зусилля з секвенування ДНК. Однак через свою простоту метод Сангера швидко став стандартом для секвенування всіляких клонованих ДНК.

Першим повним геном, який був секвенований, був бактеріофаг (бактеріальний вірус) під назвою Φx174. У той же час, як прогрес в технології секвенування відбувалися, так і деякі з ранніх розробок в технології рекомбінантної ДНК. Разом це призвело до більш ефективного та швидкого клонування та секвенування ДНК з все більш різноманітних джерел. Перша увага була, звичайно, на генах і геномах важливих модельних організмів, таких як E. coli, C. elegans, дріжджі (S. cerevisiae)..., і звичайно ми! До 1995 року Крейг Вентер та його колеги з Інституту геномних досліджень завершили послідовність цілого бактеріального генома (Haemophilus influenzae), а до 2001 року приватна група Вентера разом з Френсіс Коллінз та колегами з NIH опублікувала перший проект послідовність генома людини. Вентер довів ефективність підходу до секвенування цілого генома, який називається секвенуванням дробовика, який був набагато швидшим, ніж ген-за геном, фрагмент за фрагментом «лінійної» стратегії секвенування використовується іншими дослідниками (пізніше!). Оскільки метод секвенування ДНК дидезоксинуклеотидів Сангера залишається загальною і економічною методологією, розглянемо основи протоколу.

B. Подробиці секвенування DiDeoxy

З огляду на шаблонну ДНК (наприклад, плазмідну кДНК), Сангер використовував протоколи реплікації in vitro, щоб продемонструвати, що він може:

Реплікуйте ДНК в умовах, які випадково припинили додавання нуклеотидів у всіх можливих положеннях у зростаючих пасмах.
Відокремте, а потім виявляйте ці фрагменти ДНК реплікованої ДНК.

Нагадаємо, що ДНК-полімерази каталізують утворення фосфодіефірних зв'язків шляхом зв'язування\(\alpha \) фосфату нуклеотидного трифосфату з вільним 3' ОН дезоксинуклеотиду в кінці зростаючої ланцюга ДНК. Нагадаємо також, що рибоза цукру в дезоксинуклеотидних попередниках реплікації не має групи 2' ОН (гідроксилу). Хитрість Сангера полягала в тому, щоб додати дидезоксинуклеотидні трифосфати до його суміші реплікації in vitro. Рибоза на дидезоксинуклеотидтрифосфаті (dDNTp) не вистачає 3 'ОН, крім групи 2' OH (як показано нижче).

Додавання дидезоксинуклеотиду до зростаючої ланцюга ДНК зупиняє реплікацію. Ніякі подальші нуклеотиди не можуть додати до 3'-кінця реплікуючої ланцюга ДНК, оскільки 3'—ОН, необхідний для зневоднення синтезу наступного фосфодіефірного зв'язку, відсутній! Оскільки вони можуть зупинити реплікацію в активно зростаючих клітині, DDNTP, такі як дидезоксиаденозин (торгова назва, кордицепін), є протираковими хіміотерапевтичними препаратами.

266 Лікування раку дидезоксинуклеозидами

Погляд на протокол секвенування ДНК вручну показує, що відбувається в реакціях секвенування. Встановлено чотири реакційні трубки, кожна з яких містить матричну ДНК, яку потрібно секвенувати, праймер відомої послідовності та чотири необхідні дезоксинуклеотидні попередники, необхідні для реплікації.

Налаштування для ручного секвенування ДНК наведено нижче.

До кожної з чотирьох трубок додається інший DdNtp, (dDDTp, DdCTP, DdGtp або DdTTP). Нарешті, ДНК-полімераза додається до кожної трубки, щоб почати реакцію синтезу ДНК. Під час синтезу ДНК фрагменти нової ДНК різної довжини накопичуються, коли DDNTP включаються випадковим чином, протилежні комплементарні основи в послідовній ДНК шаблону. Очікування реакцій секвенування дідіокси в чотирьох трубках проілюстровані нижче.

Через короткий час після додавання ДНК-полімерази для початку реакцій суміш нагрівають, щоб відокремити нитки ДНК і додають свіжу ДНК-полімеразу для повторення реакцій синтезу. Ці реакції секвенування повторюються цілих 30 разів, щоб отримати достатню кількість радіоактивних фрагментів ДНК, які потрібно виявити. Коли термостійка ДНК-полімераза Taq з термофільної бактерії Thermus aquaticus стала доступна (докладніше пізніше!) , більше не потрібно було додавати свіжу ДНК-полімеразу після кожного циклу реплікації. Багато циклів нагрівання та охолодження, необхідних для того, що стало відомим як секвенування ДНК з припиненням ланцюга, незабаром були автоматизовані за допомогою недорогих програмованих термоциклерів.

Оскільки невелика кількість радіоактивного дезоксинуклеотиду (зазвичай АТФ з маркуванням 32P) була присутня в кожній реакційній трубці, новостворені фрагменти ДНК є радіоактивними. Після електрофорезу для відділення нових фрагментів ДНК в кожній трубці авторентгенографія електрофоретичного гелю виявляє положення кожного кінцевого фрагмента. Потім послідовність ДНК може бути прочитана з гелю, як показано на модельованому авторадіографі нижче.

Як показано в мультфільмі, послідовність ДНК можна прочитати, зчитуючи основи з нижньої частини гелю, починаючи з C внизу смуги С. Спробуйте прочитати послідовність самостійно!

267 Посібник з дідеоксі-секвенування

Перший напівавтоматичний метод секвенування ДНК був винайдений в Каліфорнійській лабораторії Леруа Гуда в 1986 році. Хоча все ще секвенування Сангера, чотири дидезоксинуклеотиди в реакції секвенування були позначені для виявлення флуоресцентними барвниками замість радіоактивних нуклеотидів з фосфатом. Після реакцій секвенування продукти реакції електрофорезуються на «автоматизованому секвенторі ДНК». УФ-світло збуджує мігруючі фрагменти ДНК, закінчені барвником, коли вони проходять через детектор. Колір їх флуоресценції виявляють, обробляють і відправляють на комп'ютер, генеруючи кольоровий графік, подібний до наведеного нижче, показуючи порядок (а отже, і довжину) фрагментів, що проходять детектор, і, таким чином, послідовність пасма.

Найбільш корисною особливістю цього методу секвенування є те, що шаблонна ДНК може бути секвенована в одній пробірці, що містить всі необхідні компоненти, включаючи всі чотири дидезоксинуклеотиди! Це тому, що детектор флуоресценції в секвенувальній машині окремо бачить всі короткі фрагменти DDNTP, коли вони рухаються через електрофоретичний гель.

Інновації Гуда були швидко комерціалізовані, що робить можливими великі проекти секвенування, включаючи секвенування всього генома. Швидкість автоматизованого секвенування ДНК призвела до створення великих баз даних послідовностей в США та Європі.

NCBI (Національний центр біологічної інформації) підтримує базу даних США. Незважаючи на своє розташування, NCBI архівує практично всі послідовності ДНК, визначені у всьому світі. Нові «крихітні» секвенсори ДНК зробили секвенування ДНК настільки портативним, що в 2016 році його навіть використовували на Міжнародній космічній станції. Розширення баз даних та нових інструментів та протоколів (деякі з них описані нижче) для пошуку, порівняння та аналізу послідовностей ДНК також швидко зростали.

268 Автоматизоване секвенування призводить до великих проектів геному

C. Широкомасштабне секвенування

Масштабне секвенування спрямоване на цілі прокаріотичні та, як правило, набагато більші еукаріотичні геноми. Останні вимагають стратегій, які або послідовні довгі фрагменти ДНК та/або секвенування фрагментів ДНК швидше. Ми вже відзначали секвенування дробовика, яке використовує Вентер для послідовності менших і великих геномів (включаючи наш власний... або точніше, його власний!). При секвенуванні дробовика клоновані фрагменти ДНК 1000 пар основи або довше розбиваються випадковим чином на менші, легше секвеновані фрагменти. Фрагменти самі клонуються і послідовні та ненадлишкові послідовності збираються шляхом вирівнювання областей послідовності, що перекриваються. Сьогоднішнє комп'ютерне програмне забезпечення є досить вмілим у швидкому вирівнюванні послідовності перекриття, а також підключення та відображення довгих суміжних послідовностей ДНК. Послідовність дробовика коротко викладена нижче.

Прогалини послідовності, які залишаються після секвенування дробовика, можуть бути заповнені прогулянкою праймера, в якій відома послідовність біля розриву є основою створення послідовності праймера для «прогулянки» в область розриву на неушкодженій ДНК, яка не була фрагментована. Інша методика «заповнення розривів» включає ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція, яка буде описана коротко). Коротко, два олігонуклеотиди синтезуються на основі інформації про послідовність по обидва боки розриву. Потім використовується ПЛР для синтезу відсутнього фрагмента, а фрагмент секвенується для заповнення прогалини.