15.2: Створення та екранування бібліотеки кДНК
- Page ID
- 6110
Першим кроком у створенні бібліотеки кДНК є виділення клітинної мРНК. Цей екстракт мРНК повинен представляти всі стенограми в клітині під час ізоляції або транскриптом клітини. Цей термін використовується за аналогією з геном. Однак геном - це вся генетична інформація організму. Навпаки, транскриптом (зазвичай еукаріот) відображає всі гени, виражені в даному типі клітин в даний момент часу. Зворотна транскрипція CDNA з екстракту мРНК також називають транскриптом..., а також бібліотека кДНК. Бібліотека кДНК - це трубка, наповнена бактеріальними клітинами, які взяли (тобто були перетворені) плазміди, рекомбіновані з CDNA. Бібліотеки кДНК, виготовлені з мРНК, взятих з різних типів клітин або тих самих клітин, вирощених в різних умовах, діють різні транскриптоми. Кожен відображає мРНК, транскрибувані в клітині в момент їх вилучення. Коли клітини бібліотеки кДНК розподіляються на чашці Петрі з живильним агаром, кожна клітина виростає в колонію клітин; кожна клітина в колонії є клоном початкової клітини. Бібліотеки кДНК можуть бути використані ізолювати і послідовно ДНК кодує поліпептид, який ви вивчаєте.
Нагадаємо, що зріла мРНК в клітинах-еукаріотів була зрощена. Це означає, що CDNA з еукаріотичних клітин не включають інтрони. Інтрони, а також послідовності підсилювачів та інших регуляторних елементів у гені та навколо нього повинні бути вивчені в геномних бібліотеках, які будуть розглянуті пізніше. Тут ми розглянемо, як зробити бібліотеку cDNA.
A. Будівництво кДНК
мРНК становить лише кілька відсотків еукаріотичної клітини; більшість - це рРНК. Але ця невелика кількість мРНК може бути відокремлена від інших клітинних РНК в силу їх 3' полі (А) хвостів. Просто передайте загальний екстракт РНК над стовпцем oligo-d (T) (показано нижче).
Струни тимідину (Т) можуть H-зв'язуватися з полі (А) хвостами мРНК, прив'язуючи їх до колони. Всі РНК без 3' полі (A) хвоста будуть протікати через колону як відходи. Другий буфер пропускають над колоною для дестабілізації A-T H-зв'язків для елюації фракції мРНК. Коли до елюованої мРНК додається вільний оліго d (T), він утворює H-зв'язки з полі (A) хвостами мРНК, слугуючи праймером для синтезу кДНК копій полі (A) мРНК спочатку в клітині. Нарешті, чотири дезоксинуклеотидні попередники ДНК та зворотна транскриптаза (спочатку виділена з клітин, заражених ретровірусом курки), додають для початку зворотної транскрипції. Синтез ланцюга кДНК, що доповнює мРНК, показаний нижче.
Після нагрівання, щоб відокремити CDNA від мРНК, кДНК реплікується для отримання дволанцюгової, або (ds) кДНК, як показано нижче.
Синтез другої ланцюга кДНК також каталізується зворотною транскриптазою! Фермент розпізнає ДНК, а також шаблони РНК і має таку ж активність полімеризації ДНК 5 «до 3», як ДНК-полімерази. Після 2-го синтезу ланцюга кДНК, нуклеаза S1 (однониткова ендонуклеаза, спочатку виділена з східноазіатського гриба!) додається, щоб відкрити петлю (ds) структури кДНК і обрізати решту одноцепочечной ДНК. Залишається (ds) кДНК.
B. Клонування CDNA в плазмідні вектори
Щоб зрозуміти клонування кДНК та інші аспекти створення рекомбінантної ДНК, нам потрібно трохи більше поговорити про набір інструментів рекомбінантної ДНК. Крім зворотної транскриптази і нуклеази S1, інші необхідні ферменти в «наборі» включають рестрикційні ендонуклеази (рестрикційні ферменти) і ДНК-лігазу. Природною функцією рестрикційних ферментів у бактерій є розпізнавання специфічних послідовностей місць рестрикції в ДНК фагів (найчастіше паліндромних послідовностей ДНК), гідролізувати її і таким чином уникнути зараження.
Рестрикційні ферменти, які змушують ножицями прорізати дві нитки подвійної спіралі, залишають тупими кінцями. Рестрикційні ферменти, які роблять шаховий зріз на кожній пасмі в місці їх обмеження, залишають після себе додаткові («липкі») кінці (нижче).
Якщо змішати два дволанцюгові фрагменти ДНК з однаковими липкими кінцями з різних джерел (наприклад, різних видів), вони утворюватимуть H-зв'язки на своїх доповнюючих кінцях, що полегшить рекомбінування плазмідної ДНК з (ds) кДНК, які мають однакові доповнюючі «липкі кінці». Використовуючи мову рекомбінантних ДНК-технологій, давайте розглянемо, як плазмідні вектори та CDNA можуть бути зроблені для рекомбінування.
1. Підготовка рекомбінантних плазмідних векторів, що містять вставки кДНК
Вектори є несучими ДНК, розроблені для рекомбінування з іноземними ДНК, що представляють інтерес. Коли рекомбінантний вектор зі своєю чужорідною вставкою ДНК потрапляє в клітину-господаря, він може відтворювати багато копій себе, достатньо для легкої ізоляції та вивчення. CDNA зазвичай вставляються в плазмідні вектори, які зазвичай купуються «поза полицею». Їх можна вирізати рестрикційним ферментом у відповідному місці, залишаючи ці липкі кінці. З іншого боку, не було б перетравлювати (ds) кДНК з рестрикційними ендонуклеазами, оскільки метою є не клонування фрагментів кДНК, а цілих молекул кДНК. Тому потрібно буде приєднати компонувальники до будь-якого кінця (ds) CDNA. Плазмідні ДНК та конструкції CDNA-компонувальника потім можуть бути перетравлені тим же ферментом рестрикції для отримання сумісних «липких кінців». Етапи підготовки вектора і (ds) кДНК до рекомбінації наведені нижче.
Для підготовки до рекомбінації плазмідний вектор перетравлюється рестрикційним ферментом, щоб відкрити коло ДНК. Щоб мати сумісні липкі кінці, дволанцюгові CDNA, які будуть вставлені, змішуються з лінкерами та ДНК-лігазою, щоб поставити ДНК компонувальника на обох кінцях (ds) кДНК. ДНК-лігаза - ще один інструмент у інструментарії рекомбінантної ДНК. Лінкери - це короткі синтетичні дволанцюгові олігомери ДНК, що містять місця рестрикції, розпізнані та розрізані тим же рестрикційним ферментом, що і плазміда. Після того, як лінкери прикріплені до кінців плазмідних ДНК, вони перетравлюються відповідним рестрикційним ферментом. Це залишає як (ds) CDNA, так і плазмідні вектори з додатковими липкими кінцями.
2. Рекомбінування плазмід та вставок кДНК та перетворення клітини-господаря
Наступним кроком є змішування розрізаних плазмід з перетравленими Linker-CDNA в потрібних пропорціях, щоб більша частина кінців кДНК (компонувальника) відпалювала (утворювала Hbonds) з більшою частиною липких плазмідних кінців. Додавання ДНК-лігази до суміші плазмід/лінкер-кДНК утворює фосфодіефірні зв'язки між плазмідою та вставкою кДНК, завершуючи рекомбінантний коло ДНК, як показано нижче.
У ранніх експериментах з клонування важливим фактором було створення плазмід лише з однією копією даної вставки кДНК, а не безліччю повторно лігованих плазмід без вставок або безлічі плазмід з декількома вставками. Використовуючи краще інженерні векторні та компонувальні комбінації, це питання стало менш важливим.
3. Трансформація клітин господаря рекомбінантними плазмідами
Рекомбінантні молекули ДНК тепер готові до «клонування». Вони додаються в кишкову паличку (іноді інші клітини господаря) роблять проникними, щоб вони могли легко трансформуватися. Нагадаємо, що трансформація, визначена Гріффітом, - це бактеріальне поглинання чужорідної ДНК, що призводить до генетичних змін. Принцип трансформації при клонуванні - це рекомбінантна плазміда! Крок трансформації показаний нижче.
Трубка, наповнена трансформованими клітинами, - це бібліотека кДНК.
262 Створення бібліотеки кДНК.
Після всіх цих процедур не всі молекули плазміди в суміші є рекомбінантними; деякі клітини в суміші навіть не взяли плазміду. Отже, коли рекомбінантні клітини покриті на агарі, як визначити, яка з колоній, що ростуть, прийшла з клітин, які взяли рекомбінантну плазміду? Як штам господаря кишкової палички, так і плазмідні вектори, що використовуються в ці дні, були додатково розроблені для вирішення цієї проблеми. Один такий плазмідний вектор несе ген антибіотикорезистентності. У цьому випадку чутливі до ампіциліну клітини трансформуються рекомбінантними плазмідами, що містять ген резистентності. Коли ці клітини покриваються на середовищах, що містять ампіцилін (форма пеніциліну), вони ростуть, як показано нижче.
Нетрансформовані клітини (клітини, які не змогли взяти плазміду) не мають гена стійкості до ампіциліну і, таким чином, не ростуть на ампіцилін-середовищі. Але, все ж залишається питання. Як ви можете визначити, чи були клітини, які росли, трансформувалися рекомбінантною плазмідою, що містить вставку кДНК? Цілком можливо, що деякі трансформанти містять тільки нерекомбінантні плазміди, які ще мають ген стійкості до ампіциліну!
Для вирішення цього питання плазміди були додатково розроблені геном резистентності до стрептоміцину. Але цей ген стійкості до антибіотиків також був розроблений таким чином, щоб містити рестрикційні ферменти в середині гена. Таким чином, введення кДНК в цю плазміду порушить та інактивувати ген. Ось як цей другий біт генної інженерії дозволив ріст лише клітин, перетворених рекомбінантною плазмідою, що містить вставку кДНК. Ми можемо визначити трансформанти, що містять рекомбінантні плазміди, крім тих, що містять нерекомбінантні плазміди, за методикою покриття репліки, показаної (ілюстровано нижче).
Після того як колонії виростуть на агарі агару агару агару, над плитою викладають фільтр. Фільтр забере кілька клітин з кожної колонії, по суті стаючи реплікою (дзеркальним відображенням) колоній на тарілці. Помістіть фільтр репліки на нову агарову пластину, що містить стрептоміцин; нові колонії, які ростуть на фільтрі, повинні бути стійкими до стрептоміцину, що містять тільки нерекомбінантні плазміди. Колонії, що містять рекомбінантні плазміди, ті, які не виросли в стрептоміцині, легко ідентифікуються на вихідній агарової пластинці ампіциліну. На практиці високоефективні процедури рекомбінації та трансформації зазвичай виявляють дуже стійкі до стрептоміцину клітини (тобто колонії) після покриття репліки. При цьому клітини, стійкі до ампіциліну, складають хорошу бібліотеку кДНК, готову до скринінгу.
4. Визначення колоній, що містять плазміди, із вставками, що представляють інтерес
Наступним кроком є перевірка колоній з бібліотеки кДНК для тих, що містять певну кДНК, яку ви шукаєте. Зазвичай починається підготовка декількох фільтрів реплік, як описаний вище. Пам'ятайте, ці фільтри є репліками бактеріальних клітин, що містять рекомбінантні плазміди, які ростуть на ампіцилін, але не стрептоміцин. Кількість фільтрів реплік, які необхідно перевірити, можна обчислити за припущеннями та формулами для оцінки того, скільки колоній потрібно обстежувати, щоб представляти цілий транскриптом (тобто кількість різних мРНК у вихідному джерелі клітинної мРНК). Після того, як необхідна кількість фільтрів репліки зроблені, вони піддаються in situ лізису для порушення клітинних стінок і мембран. Результатом є те, що вміст клітин вивільняється, а ДНК денатурується (тобто стає однонитковим). Потім ДНК прилипає до фільтра на місці (in situ, де були колонії). Результатом in situ lysis є фільтр зі слабкими слідами початкової колонії (нижче).
Далі використовується молекулярний зонд для ідентифікації ДНК, що містить цікавить послідовність. Зонд часто є синтетичним олігонуклеотидом, послідовність якого була виведена з відомих амінокислотних послідовностей. Ці олігонуклеотиди зроблені радіоактивними і поміщені в мішок з фільтром (s). ДНК з клітин, які містили рекомбінантні плазміди з цікавою кДНК, зв'яже комплементарний зонд. Результати in situ лізису та гібридизації радіоактивного зонда до фільтра репліки наведені нижче.
264 Зондування репліки пластинчастого фільтра
Фільтри промивають для видалення незв'язаного радіоактивного олігомерного зонда, а потім поміщають на рентгенівську плівку. Після періоду витримки плівка виробляється. Чорні плями утворюватимуться на плівці від радіоактивного впливу, створюючи авторадіограф фільтра. Чорні плями в авторадіографі відповідають колоніям на фільтрі, які містять рекомбінантну плазміду з вашою цільовою послідовністю кДНК (нижче).
Як тільки позитивний клон ідентифікований на плівці, відповідна рекомбінантна колонія розташовується на вихідній пластині. Ця колонія вирощується в рідкій культурі і виділяється плазмідна ДНК. У цей момент клонована плазмідна ДНК може бути секвенована, а послідовність амінокислот, закодована її кДНК, може бути виведена зі словника генетичного коду, щоб переконатися, що вставка кДНК насправді кодує білок, що цікавить. Після перевірки як послідовність інтересів клонована плазмідна кДНК може бути зроблена радіоактивною або флуоресцентною і використана для
- зонд для генів, з яких вони виникли.
- ідентифікувати та кількісно визначити мРНК навіть знайти стенограми в клітині.
- кількісно виміряти кількість конкретних МРНК.
Ізольовані плазмідні CDNA можуть бути навіть експресовані у відповідних клітині, щоб зробити закодований білок. У ці дні діабетики більше не отримують свинячий інсулін, а отримують синтетичний людський інсулін, виготовлений з експресованих людських CDNA. Більше того, хоча введення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР, див. Нижче) замінило деякі види використання CDNA, вони все ще відіграють певну роль у дослідженнях на рівні генома та транскриптома.