14.4: Транспонування з МакКлінтока
- Page ID
- 6081
Транспозони існують скрізь, де ми дивимося на прокаріотів і складаємо значну частину еукаріотичної повторюваної ДНК. Таким чином, вони можуть бути великою часткою еукаріотичних геномів, включаючи деякі, які вже навіть не транспонують. Транспозони колись вважалися марною або небажаною ДНК, без очевидної функції..., або егоїстичними генами без іншої мети, крім самовідтворення. Але в світлі якихось нових доказів, можливо, ні!
Як ви побачите, механізми транспозиції мають багато особливостей з реплікацією ДНК, рекомбінацією та відновленням, і навіть вірусною інфекцією. Коли ви вивчаєте ці механізми, тримайте в задній частині розуму, що транспозиція часто викликається клітинним стресом.
А. послідовності вставки (елементи IS)
Бактеріальні елементи ІС були першими рухомими елементами, описаними після тих, що містяться в кукурудзі. Як ми побачимо, вони поділяють деякі структурні особливості еукаріотичних транспозонів. Виявлені наприкінці 1960-х років, багато з них були ідентифіковані (IS1, IS2..., IS10 тощо). Деякі з них вставляються в відомі гени (наприклад, в лак-опероні), але більшість з них не є, ймовірно, тому що в компактному бактеріальному геномі мало «зайвої» ДНК. Без додаткової некодуючої ДНК для буфера проти пошкоджуючих мутацій, кілька бактеріальних клітин живуть, щоб розповісти історію транспозиції! Це повинно здивувати нас, що елементи ІС можуть бути змушені транспонувати в лабораторії, але, як правило, мовчать в природі.
Члени сімейства елементів ІС варіюються по довжині приблизно від 750 до 1425 б.п. У межах цієї ділянки ДНК лежать транспозаза і резольваза гени, продукти яких необхідні для рухливості. На будь-якому кінці елемента ІС перевернуті повтори, а при виявленні в геномній або плазмідній ДНК, сама послідовність ІС фланкується прямими повтореннями генома господаря або плазмідної ДНК, які виникають в результаті механізму транспозиції. Знову ж таки, через свої компактні геноми бактерії можуть переносити лише низьку кількість копій елементів ІС у своєму геномі або на плазмідах (менше десяти копій і лише одного!). Типовий елемент IS проілюстрований нижче.
B. Композитні транспоноси: десять елементів
Якщо пара елементів ІС повинна лежати близько один до одного, розділені коротким відрізком геномної або плазмідної ДНК, вони можуть транспонувати разом, несучи між собою ДНК як частина композитного транспозона, або елемента Tn. Якщо деяка частина ДНК між елементами ІС в елементі Tn містить гени резистентності до антибіотиків, її транспозиція може переносити і поширювати ці гени на іншу ДНК в клітині. Tn елементів (як елементи IS) присутні в низькому числі копії. Нижче наведено загальний елемент Tn.
Гени резистентності до антибіотиків турбують медичне співтовариство; їх поширення призвело до стійких до антибіотиків патогенів, які викликають захворювання, які все важче і навіть неможливо лікувати. Раніше ми спостерігали генетичну «трансформацію» стрептококових клітин, які збирають гени вірулентності в ДНК з мертвих клітин. Ми регулярно трансформуємо клітини плазмідами в рамках експериментів з рекомбінантною ДНК. Але бактерії можуть переносити плазмідну ДНК між собою цілком природно. Під час бактеріальної кон'югації плазміда F (фертильність) зазвичай переносить ДНК між сумісними типами спаровування бактерій (перегляньте кон'югацію бактерій в інших місцях цього тексту для отримання більш докладної інформації). Таким чином, плазміда F, що містить елемент Tn, що містить ген резистентності до антибіотиків, може передаватися від донора до реципієнта під час кон'югації. Елемент Tn може транспонуватися в реципієнт бактеріального геному. Таким чином, транспозиція є основним шляхом передачі та поширення резистентності до антибіотиків.
C. складні транспозони
Бактеріальні складні транспозони також містять інші гени на додаток до тих, які необхідні для рухливості. Деякі складні транспозони нагадують бактеріофаг, або, як у випадку з фагом Му, насправді є фагами! Насправді Му може функціонувати або як інфекційний фаг, який розмножується в інфікованій клітині, або як транспозон в бактеріальному геномі. Транспозон гени в Mu фага проілюстровані нижче.
Після зараження бактерією Му може увійти в літичну фазу свого життєвого циклу, реплікуючи її ДНК, виробляючи і в кінцевому підсумку вивільняючи нові інфекційні фагові «частинки» шляхом лізування бактеріальної клітини господаря. Як варіант, як і інші фаги, Му може піддаватися лізогенезу, вставляючи свою ДНК в хромосому клітини господаря. Інтегровані копії Mu можуть акцизувати і знову увійти в літичну фагу, щоб виробляти більше фагів, особливо якщо деякий екологічний стрес загрожує виживанню бактерій господаря. Але третій вибір способу життя, транспозиція, доступний Му, як тільки фаг інтегрується в бактеріальну хромосому. Три варіанти способу життя для Mu phage проілюстровані на наступних кількох сторінках.
Літичні та лізогенні варіанти способу життя для Mu фагів показані нижче.
Му фаг ДНК може діяти як транспозіруемий елемент, перебуваючи в лізогенному шляху, як показано нижче
264 Бактеріальні мобільні елементи
Перейшовши до опису еукаріотичних транспозонів, шукайте подібності з бактеріальними елементами IS та Tn.
Огляд еукаріотичних транспозіруваних елементів
Існує два класи транспозонів у еукаріот:
Клас I (Ретротранспозони) рухається/'стрибати' шляхом транскрипції РНК в одному локусі з подальшою зворотною транскрипцією і інтеграцією кДНК назад в геномну ДНК в іншому місці. Ретротранспозони можуть бути отримані від (або бути джерелом) ретровірусів, оскільки активні ретровіруси висікають і інтегруються в ДНК так само, як ретротранспозони. Ретропозони - це підклас ретротранспозонів (див. Нижче).
Клас II (транспозони ДНК) рухаються по одному з двох механізмів. У шляху вирізати і вставити, транспозон залишає один локус і інтегрується в інший. У реплікативному шляху оригінальний транспозон залишається на місці, тоді як нові копії є мобільними. У таблиці нижче наведено розподіл і частка геномів, представлених різними класами/типами транспозіруемих елементів.
Таблиця підтверджує, що бактерії містять мало транспозонів, тоді як еукаріоти широко варіюються в транспозонному навантаженні (транспозони у відсотках від геномної ДНК), від 4% до більш ніж 70%.
У таблиці нижче узагальнено транспозіруються елементи за класом, підтипом, розміром, геномним розподілом, механізмом транспозиції тощо.
Між двома таблицями вище можна зробити висновок наступне:
- Транспозонне навантаження не корелює з еволюційною складністю організмів.
- Спільні транспозони мають різні еволюційні історії в різних організмах.
- Там, де транспозони залишаються активними, вони продовжують формувати геномні ландшафти, особливо у організмів з високим навантаженням транспозонів.
Деякі з цих висновків ми повернемося пізніше, подивившись на структуру і механізм рухливості різних транспозіруемих елементів.
Е. структура транспозонів еукаріотичної ДНК (клас II)
Активні еукаріотичні транспозони ДНК поділяють структурні особливості з бактеріальними рухомими елементами, включаючи гени, необхідні для транспозиції, флангові інвертовані повтори та флангові прямі повторення ДНК клітин господаря. Характерна структура еукаріотичного транспозону ДНК показана нижче.
Транспозони класу II можуть «стрибати» за допомогою вирізаних та вставлених або реплікативних механізмів. Транспонування «Вирізати і вставити» видаляє копію з одного місця і переміщує (переносить) її в інше місце. Як випливає з назви, реплікативна транспозиція залишає копію оригінального транспозону на місці під час вставки нової копії в іншому місці генома. Транспонування за допомогою механізму вирізання та вставки наведено на схемі нижче.
Зверніть увагу, що після транскрипції гена транспози фермент ніксує ДНК і обрізає 3'OH закінчується, щоб створити шаховий розріз, щоб висікати транспозон. Транспозаза фактично приносить транспозон закінчується разом під час кроку різання і опосередковує його вставку на новому місці ДНК. Після лігування 3'OH закінчується транспозон до 5'OH на місці вставки, реплікація замінює відсутні основи, генеруючи прямі повторення геномного ДНК клітини господаря в місці вставки. Завершальний крок лігування завершує транспозицію.
У реплікативної транспозиції транспозон також ніксує і обрізає ДНК на місці її джерела (вихідного) вставки. Але, на відміну від механізму різання і пасти, вихідний транспозон не січуть.
Детально про реплікативний механізм транспозиції узагальнено нижче.
Після вирізання 3' кінці транспозону в місці вставки, транспозаза тримає транспозон закінчується разом, каталізуючи гідролітичну атаку ДНК на новому місці вставки. Після цього слід грунтування транспозон реплікації нитки з 3'OH кінців ниток ДНК місця вставки. Форми коінтеграції структури, в якій кожна транспозонна копія була зроблена напівконсервативної реплікації. Коінтеграт вирішується одним з двох рекомбінаційних механізмів. Результат залишає копії транспозон як на вихідному сайті, так і на новому місці вставки.
Давайте порівняємо та порівняємо особливості вирізаної та реплікативної транспозиції ДНК. Загальні риси полягають у тому, що:
- Транспозон-кодований транспозаза зв'язується, приносить транспозон кінці разом і каталізує одножильний розщеплення (гідроліз) залишаючи «шахові кінці».
- Transposase тримає транспозон закінчується разом для інших кроків.
Відмінності між двома механізмами полягають у тому, що при транспозиції cut & paste транспозон повністю висікається, а потім переноситься на новий сайт в геномній ДНК. На відміну від цього, після одного багатониткового розщеплення в реплікативної транспозиції, транспозаза-пов'язані вільні 3' кінці транспозону гідролізують обидві нитки багатониткової ДНК на новому місці вставки. Після лігування 3' кінців транспозонних ниток до 5' кінців вирізаних геномних ДНК вставки-сайт закінчується, решта 3' кінці місця вставки ДНК закінчується першою реплікацією транспозону, утворюючи коінтегрувати, який супроводжується його роздільною здатністю по одному з двох шляхів рекомбінації.
F. структури транспозонів еукаріотичної РНК (клас I)
Як і транспозони ДНК, всі транспозони РНК залишають сліди місця вставки, тобто прямі повторення геномної ДНК, що фланкує елемент. На відміну від транспозонів ДНК, активні еукаріотичні транспозони класу I рухаються через проміжний проміжний РНК. Також на відміну від транспозонів ДНК, їм не вистачає термінальних перевернутих повторів.
Рухливість проміжного проміжного РНК всіх ретротранспозонів вимагає промотора, який розпізнає фермент зворотної транскриптази, а також ендонуклеази та ферменти інтегрази (буде описано нижче). Автономні РНК-транспозони класу I включають ретротранспозони LTR (наприклад, дріжджовий елемент Ty), а також ретротранспозони без LTR). До останніх відносяться автономні лінії (L Long I перемежовується N ядерних елементів Е). Автономні лінії LTR та Non-LTR містять та експресують гени, необхідні для ферментів, необхідних для транспозиції. З іншого боку, SINES (підклас не-LTR ретротранспозонів) не вистачає генів для ферментів, необхідних для транспозиції, і тому не може транспонувати самостійно. Таким чином, вони є неавтономними ретротранспозонами, які покладаються на «справжню» (автономну) ретротранспозонну активність для мобільності. SINE іноді називають ретропозонами, щоб відрізнити їх від автономних ретротранспозонів.
249 Вступ до особливостей ретротранспозиції
Далі ми детальніше розглянемо ретротранспозонні структури та гени та активність ферментів, необхідні для ретротранспозиції.
1. LTR ретротранспозонів: Дріжджі Ty елемент
Транспозон Ty містить кілька генів, необхідних для транспозиції. До них відносяться:
- ген Gag, який кодує груповий специфічний антиген, білок, який утворює вірусоподібну частинку, яка буде містити зворотну транскрибовану транспозонну ДНК,
- ген RT, який кодує зворотну транскриптазу, яка зробить зворотні транскрибовані копії ретротранспозонних стенограми РНК.
- ген Prt, який кодує протеазу, яка розщеплює вірусоподібну частинку, коли ретротранспозон потрапляє в ядро.
- ген Int, який кодує інтегразу, необхідну для інтеграції ретротранспозону в геномну ділянку вставки ДНК.
Представницький елемент Ty показаний нижче, оскільки він існував би інтегрований у геномну ДНК дріжджів.
Насправді багато подій в транспозиції Ty відбуваються в цитоплазматичної «вірусоподібної частинки» в дріжджових клітині. Щоб побачити більше, натисніть тут. Зауважте, що область Pol на ілюстрації вище складається з перекриття відкритих кадрів читання (ORF), які кодують гени Prt, RT та Int. Готовий до переміщення транспозон складається тільки з області ДНК, символізованої жовтим кольором.
2. Ретротранспонатори без LTR: Лінії
Лінії (L Long I перемежовуються N ядерних елементів E) також кодують ферменти, необхідні для транспозиції і, як і інші транспозони, генерують прямі повтори цільового сайту флангові вставлений елемент. Але у них немає довгих термінальних повторів! Натомість їх ORF (гени) фланкуються 5' та 3' неперекладеними регіонами (UTRs).
Будова людської лінії L1 наведено нижче.
5' UTR містить промотор, з якого клітинна РНК-полімераза II може транскрибувати гени нижче за течією (див. Розділ транскрипції). Другий з них (ORF2) кодує зворотну транскриптазу та інтегразну активність, необхідну для транспозиції ЛІНІЇ. Всі автономні транспозони класу I (РНК-проміжний) мають такі особливості:
а) промоутер у 5' UTR, з якого вони можуть бути транскрибовані.
б) зворотна транскриптаза, яка генерує кДНК копію транспозіруемого елемента.
в) РНАза Н (ендонуклеаза), яка погіршує цю розшифровку після зворотної транскрипції.
г) Інтеграза (як транспозаза), що каталізує вставку ретротранспозонної копії в місцях вставки.
3. Non-LTR SINE ретротранспозони
Ретротранспозони без LTR SINE зазвичай не мають генів, але їх негенна ДНК, тим не менш, фланкується 5' та 3' УТР. РНК-полімераза III, яка також транскрибує трансферні РНК, також транскрибує SINE. Однак для транспонування вони покладаються на одночасну активність транспозону, що не є LTR (ЛІНІЯ), щоб забезпечити необхідну ферментативну діяльність.
Типовий SINE (наприклад, елемент Alu) показаний нижче.
Г. Механізми ретротранспозиції
Існує два механізми ретротранспозиції: екстрахромосомно грунтована ретротранспозиція (наприклад, ретротранспозони LTR) та вставка цільового сайту з грунтованою ретротранспозицією (ретротранспозони без LTR, такі як Lines та SINE). Ці будуть розглянуті далі.
1. Екстрахромосомно грунтована ретротранспозиція (наприклад, LINE)
Як випливає з назви, в екстрахромосомно грунтованій ретротранспозиції кругова зворотна розшифровка ретротранспозонних атак, нікс і інтегрується в геномну ділянку вставки. У цьому механізмі зворотна транскриптаза створює кДНК копію транскрибованого ретро-елемента. Інтегра/ендонуклеаза потім зв'язує копію кДНК, утримуючи кінці разом, фактично циркулюючи її. Цей ізольований рибонуклеопротеїн нагадує інтасому, структуру, схожу на нуклеопротеїновий комплекс, який каталізує інтеграцію ретровірусних CDNA під час лізогенезу.
Екстрахромосомно грунтована ретротранспозиція проілюстрована нижче.
Нещодавно була визначена тривимірна структура ретровірусної інтасоми, що взаємодіє з ДНК та нуклеосомами (докладніше див. Ретровірусна інтасома 3D Structure). У такому вигляді ретротранспозон атакує ДНК в місці введення, створюючи шахові кінці. Після введення заповнюються прогалини в ДНК. Лігування ущільнює ретротранспозон у своєму новому місці, створюючи прямі повторення місця вставки.
2. Ретротранспозиція SINE на цільовому майданчику (наприклад, SINE)
Ключовою особливістю цільового сайту грунтованої ретротранспозиції (ретропозиції) є відсутність інтегрально пов'язаної, кругової двожильної зворотної транскрипти. При транспозиції SINE РНК-полімераза III (той самий фермент, який каталізує транскрипцію тРНК і 5S рРНК) транскрибує SINE. Якщо LINE одночасно транскрибується, його ферменти будуть зроблені. Коли його інтеграс-ендонуклеаза каталізує гідроліз однієї нитки ДНК на новому місці вставки, кінець 3'OH цієї нитки може прогрунтувати зворотну транскрипцію однієї ланцюга SINE кДНК за допомогою зворотної транскриптази LINE. Після гідролізу другої ланцюга ДНК цільової ділянки її 3'-ОН закінчується праймами реплікації другої нитки SINE кДНК. Integrase завершує вставку копі-синуса в його нове геномне розташування. Нижче проілюстровано механізм ретротранспозиції ретротранспозиції цільового майданчика.
