14.2: Складність геномної ДНК
- Page ID
- 6082
До 1960-х років, коли Рой Бріттен та Ерік Девідсон вивчали регуляцію генів еукаріотів, вони знали, що ДНК більш ніж достатньо для обліку генів, необхідних для кодування організму. Також було ймовірно, що ДНК була більш структурно складною, ніж спочатку вважалося. Вони знали, що градієнтне центрифугування щільності хлориду цезію (CScL) відокремлювало молекули на основі відмінностей у щільності і що фрагментована ДНК розділиться на основну та незначну смугу різної щільності в центрифужній трубці. Мінорний діапазон отримав назву супутникової ДНК, нагадуючи супутник Супутник, недавно запущений Росією. ДНК-смуги різної щільності не могли існувати, якби пропорції A, G, T і C в ДНК (вже відомі як специфічні для виду) були однаковими у всьому геномі. Натомість повинні бути ділянки ДНК, які багатші на A-T, ніж пари G-C, і навпаки. Аналіз супутникових діапазонів, які рухалися далі по градієнту (тобто були більш щільними), ніж основна смуга, був дійсно багатшим за змістом GC. Ті, що лежали над основною смугою, були більш багатими.
Розглянемо ранні оцінки того, скільки генів може знадобитися, щоб зробити людину, мишу, курку або петунію: близько 100 000! Тепер ми знаємо, що це займає менше! Тим не менш, навіть при завищених оцінках кількості генів, необхідних для створення типового еукаріота, їх геноми містять в 100-1000 разів більше ДНК, ніж необхідно для обліку 100 000 генів. Як же тоді пояснити цю зайву ДНК? Елегантні експерименти з кінетики ренатурації Бріттена та Девідсона виявили деякі фізичні характеристики генів та так званої «додаткової» ДНК. Давайте розглянемо ці експерименти досить докладно.
A. Кінетичний протокол ренатурації
Першим кроком у кінетичному експерименті з ренатурацією є зсув ізолятів ДНК до середнього розміру 10 Kbp шляхом проштовхування високомолекулярної ДНК через підшкірну голку при постійному тиску. Отримані двониткові фрагменти (dsDNA) потім нагрівають до 100 o С до денатурації (відокремлення) двох ниток. Потім розчини охолоджуються до 600C, щоб дозволити одиничним багатонитковим фрагментам ДНК (SSDNA) повільно реформувати додаткові подвійні нитки. У різний час після інкубації при 60oC відбирали частково ренатуровану ДНК, а ssDNA та dsDNA відокремлювали та кількісно оцінювали.
Експеримент узагальнений на малюнку нижче.
Кількість, або відсоток ДНК, яка була ренатурована з часом, може бути графічна.
B. Кінетичні дані ренатурації
Змова dsDNA формується в різний час (з багатьох днів!) показано нижче для експерименту з кінетики ренатурації з використанням ДНК щурів.
У цьому прикладі фрагменти ДНК можуть бути розміщені в трьох основних групах з різною загальною швидкістю ренатурації. Бріттен і Девідсон міркували, що дДНК, яка сформувалася найбільш швидко, складалася з послідовностей, які повинні бути більш повторюваними, ніж решта ДНК. Геном щурів також мав меншу кількість більш помірно повторюваних фрагментів dsDNA, які відпалювали більше часу, ніж сильно повторювана фракція, і навіть менше дуже повільно повторного відпалу фракції ДНК. Останні послідовності були настільки рідкісними в екстракті, що їм може знадобитися кілька днів, щоб відновити подвійні нитки, і були класифіковані як неповторювані, унікальні (або майже унікальні) послідовності ДНК, як показано нижче.
Стало зрозуміло, що геном щурів (насправді більшість еукаріотичних геномів) складається з різних класів ДНК, які відрізняються своєю надмірністю. З графіка дивно велика частка генома повторювалася в більшій чи меншій мірі.
238 Відкриття повторюваної ДНК
Коли для ДНК кишкової палички визначали кінетику ренатурації, був помічений лише один «клас надлишковості» ДНК, як показано нижче.
Виходячи з досліджень картографування генів E. coli та невеликого розміру «хромосоми» кишкової палички, розумним припущенням було те, що в бактеріальному геномі мало місця для «додаткової» ДНК, і що єдиний клас ДНК на цій ділянці повинен бути ДНК унікальної послідовності.
C. Геномна складність
Бріттен і Девідсон визначали відносну кількість повторюваних і унікальних (або однокопійних) послідовностей ДНК в геномі організму як його геномну складність. Таким чином, прокаріотичні геноми мають меншу геномну складність, ніж еукаріоти. Використовуючи ті ж дані, що і на попередніх двох графіках, Бріттен і Девідсон продемонстрували різницю між еукаріотичною та прокаріотичною складністю генома простим доцільним. Замість того, щоб будувати фракцію утвореної dsDNA проти часу ренатурації, вони побудували відсоток повторно асоційованої ДНК проти концентрації ренатурованої ДНК, помноженої на час, який ДНК прийняв для відродження (значення CoT). Коли значення CoT з даних ренатурації щурів та E. coli побудовані на одному графіку, ви отримаєте криві CoT на графіку нижче.
Це оманливо простий додатковий розрахунок (з тих же даних!) дозволяє порівнювати складнощі будь-якої кількості геномів. Ці криві CoT говорять нам, що ~ 100% бактеріального генома складається з унікальних послідовностей порівняно з геном щурів з трьома класами надлишковості ДНК. Прокаріотичні геноми дійсно значною мірою складаються з унікальної (неповторюваної) послідовності ДНК, яка повинна включати однокопійні гени (або оперони), які кодують білки, рибосомальні РНК та переносять РНК.
Функціональні відмінності між класами CoT ДНК
Наступне питання, звичайно, полягало в тому, які послідовності повторюються, а які є «унікальними» в еукаріотичній ДНК? Еукаріотичні супутникові ДНК, транспозони та гени рибосомальних РНК були ранніми підозрами. Щоб почати відповідати на ці питання, супутникова ДНК була виділена з градієнтів CScL, зроблена радіоактивною, а потім нагріта, щоб відокремити нитки ДНК. В окремому кінетичному експерименті з ренатурації ДНК щурів було відібрано в різний час. Ізольовані фракції Cot були знову денатуровані та змішані з теплоденатурованою радіоактивною супутниковою ДНК. Потім суміш охолоджують, щоб забезпечити ренатурацію. Експериментальний протокол проілюстрований нижче.
Результати цього експерименту показали, що радіоактивна супутникова ДНК лише відпалюється до ДНК з низької фракції Cot (сильно повторюваної) фракції ДНК. Таким чином, супутникова ДНК сильно повторюється в еукаріотичному геномі. У подібних експериментах ізольовані РРНК виготовляли радіоактивні сформовані РНК-ДНК гібриди при змішуванні та охолодженні з денатурованою середньою фракцією CoT еукаріотичної ДНК. Таким чином, гени рРНК були помірно повторюваними. З появою рекомбінантних ДНК-технологій надмірність інших видів ДНК досліджувалася за допомогою клонованих генів (кодування рРНК, білків, транспозонів та інших послідовностей) для зондування фракцій ДНК, отриманих в результаті експериментів з кінетики ренатурації. Результати таких експериментів зведені в таблицю нижче.
У таблиці порівнюються властивості (довжини, номер копії, функції, відсоток генома, розташування в геномі і т.д.) різних видів повторюваної послідовності ДНК. Спостереження, що більша частина еукаріотичного генома складається з повторюваної ДНК, і що транспозони можуть становити до 80% геному, було несподіванкою!
240 Визначення різних видів ДНК кожної фракції CoT
241 Деякі повторювані функції ДНК
Далі ми зосередимося на різних видах транспозіруемих елементів