13.2: Пост-транскрипційний контроль експресії генів

Не так давно ми думали, що дуже мало еукаріотичного генома коли-небудь транскрибували. Ми також думали, що єдиними некодуючими РНК є ТРНК і РРНК. Тепер ми знаємо, що інші РНК відіграють роль у регуляції генів та деградації відпрацьованої клітинної ДНК або небажаної чужорідної ДНК. Про них докладно розглянуто нижче.

А. рибосоми

Рибоперемикачі - це механізм транскрипції бактерій для регулювання експресії генів. Хоча цей механізм не є конкретно посттранскрипційним, він включений сюди, оскільки дія відбувається після ініціації транскрипції та припиняє завершення мРНК. Коли мРНК для ферменту в шляху синтезу гуаніну транскрибується, вона складається в структури стовбура і петлі. Синтез ферментів буде тривати до тих пір, поки клітина повинна зробити гуанін. Але якщо гуанін накопичується в клітині, надлишок гуанін зв'яже елементи стовбурової петлі біля 5' кінця мРНК, викликаючи РНК-полімеразу та частково завершену мРНК дисоціюють з ДНК, передчасно закінчуючи транскрипцію. Основа регуляції гуанінового рибоперемикача експресії ферменту шляху синтезу гуаніну показана нижче.

232 рибоперемикачі переривають бактеріальну транскрипцію

Здатність формувати складені структури стовбурової петлі на 5' кінцях бактеріальних мРНК, здається, дозволила еволюцію стратегій регулювання перекладу. У той час як взаємодія гуаніну зі структурою стовбурової петлі формується 5' мРНК може перервати власну транскрипцію, подібні малі метаболіти/мРНК і навіть взаємодії білків/мРНК також можуть регулювати (в цьому випадку запобігти) трансляцію. Як ми побачимо незабаром, 5' мРНК складчасті структури також відіграють певну роль у регулюванні еукаріотичного перекладу.

233 Малі метаболіти також регулюють трансляцію бактеріальної мРНК

Б. CRISPR/CAS: РНК-білковий комплекс прокаріотичної адаптивної імунної системи

У вищих організмів імунна система адаптивна. Він запам'ятовує попередній вплив збудника і, таким чином, може встановити реакцію на повторне вплив того ж збудника. Відкриття «адаптивної імунної системи» у багатьох прокаріотів (бактерій, архебактерій) стало чимось несподіванкою.

CRISPR (C кластерний R регулярно I перетинаються S короткий P аліндромний R повтору) РНК походять з фагових стенограм, які взаємодіяли з білками, пов'язаними з CRISPR (Cas). Вони складають систему CRISPR/Cas, яка, здається, еволюціонувала для боротьби з вірусною інфекцією, націлюючи фагову ДНК на знищення. Коли вірусна ДНК потрапляє в клітину під час фагової інфекції, вона може генерувати генний масив CRISPR/CAS в бактеріальному геномі, з розпірними послідовностями ДНК, що розділяють повтори генів CRISPR. Ці залишки фагової інфекції є пам'яттю цієї р рокаріотичної імунної системи. Коли фаг намагається повторно заразити раніше оголену клітину, транскрибуються розпірні РНК та гени Cas. Після трансляції мРНК Cas білок Cas та розпірні РНК будуть залучати та націлювати вхідну фагову ДНК для знищення, щоб запобігти зараженню. Таким чином, системи CRISPR/CAS (існує більше однієї!) запам'ятовувати попередні фагові атаки і передати цю пам'ять клітинам потомства. Система CRISPR/Cas9 у Streptococcus pyogenes є однією з найпростіших з цих систем імунного захисту (ілюстровано нижче).

Масив генів CRISPR/CAS складається з наступних компонентів:

• Cas: Гени, рідні для клітин господаря
• CRISPR: 24-48 bp повторює рідні для клітин господаря
• ДНК спейсера: ДНК між CRISPR повторюється: як правило, фагова ДНК від попередньої фагової інфекції або плазмідна трансформація
• ДНК лідера: Містить промотор для транскрипції РНК CRISPR/Spacer
• ген tracr: Кодує активатор транскрипції (tracr) РНК (не всі системи)

Давайте розглянемо CRISPR/CAS в дії.

1. Імунна відповідь CRISPR/CAS

Розглянемо механізм дії цієї прокаріотичної імунної системи. Дія починається, коли інфекційна фагова ДНК потрапляє в клітину, як показано нижче.

Давайте підсумуємо, що тут сталося:

а) Вхідна фагова ДНК була виявлена після фагової інфекції.

б) Потім гени tracr і Cas транскрибуються разом з областю CRISPR/Spacer. МРНК Cas переводяться, щоб зробити білок Cas. Пам'ятайте, що розпірні ДНК в регіоні CRISPR є спадщиною попередньої фагової інфекції.

в) РНК CRISPR/Spacer утворює водневі зв'язки з додатковою областю РНК тракру, оскільки дві РНК асоціюються з білками Cas.

г) Ендонуцелази білка Cas гідролізують розпірну РНК з послідовностей РНК CRISPR. Розпірні РНК залишаються пов'язаними з комплексом, тоді як фактичні, недосконало паліндромні послідовності CRISPR (показані синім кольором на ілюстрації вище) відпадають.

У наступних кроках фагові розпірні РНК, які тепер називаються провідними РНК (або GRNA) «направляють» зрілі комплекси РНК Cas9/TracrNa/Spacer до нових вхідних фагових ДНК в результаті фагової атаки. Зв'язок комплексу з вхідною фагової ДНК і подальшими подіями проілюстровані нижче.

Ще раз підведемо підсумки:

а) Spacer (тобто gRNA) в комплексних мішенях, що надходять на фагову ДНК.

б) Cas helicase розмотує вхідну фагову ДНК в додаткових областях.

в) H-зв'язки gРНК до вхідної фагової ДНК.

г) Ендонуклеази Cas створюють дволанцюговий розрив (гідролітичне розщеплення) на певних ділянках вхідної фагової ДНК. Оскільки точне розщеплення ланцюга ДНК ділянки керується молекулами РНК, ендонуклеази CRISPR/CAS класифікуються як ферменти рестрикції типу V.

д) Входить фагова ДНК руйнується і нова фагова інфекція абортується.

Перевірте тут, щоб дізнатись більше про те, як бактерії набувають розпірні ДНК, а отже, як ця примітивна адаптивна імунна система «запам'ятовує») в першу чергу

2. Використання CRISPR/CAS для редагування/інженера генів

Ранні дослідження продемонстрували відтворюване розщеплення вхідної фагової ДНК при специфічних нуклеотидах. Кілька лабораторій швидко зрозуміли, що можливо адаптувати систему, щоб вирізати ДНК практично на будь-який конкретний нуклеотид в цільовій ДНК! Виявилося, що система працює як in vivo, так і in vitro, дозволяючи практично необмежений потенціал для редагування генів і РНК в пробірці... або в будь-якій клітині. Ось основний процес:

а) Інженер gDNA з CS-специфічною послідовністю ДНК, яка націлена на бажану мішень в геномній ДНК.

б) Fuse gDNA, щоб простежити ДНК, щоб зробити одну провідну ДНК (sGDNA), щоб вона могла бути зроблена як єдиний провідний стенограма (sgRNA).

в) Інженер генного масиву CRISPR/Cas9, який замінює цю SGDNA для своїх оригінальних розпірних ДНК.

г) Помістіть інженерний масив у плазміду поруч із регульованими промоторами.

д) Трансформуйте клітини за допомогою «електропорації» (працює майже для будь-якого типу клітин!)

f) Активуйте промотор для транскрибування генів CRISPR/Cas9...

Програми потужні... і суперечливі!

3. Влада і суперечка

Застосування редагування генів за допомогою систем CRISPR/CAS вже полегшило дослідження функції генів in vitro, в клітині та в цілих організмах. Натисніть тут для опису CRISPR/CAS додатків, які вже є на ринку! Ефективність редагування специфічних генів за допомогою систем CRISPR/CAS дає великі перспективи для розуміння базової структури та функції генів, визначення генетичної основи захворювання та прискорення пошуку генної терапії. Ось лише кілька прикладів того, як застосовуються підходи CRISPR/CAS.

• Можна розробити sGRNA з бажаними мутаціями, орієнтованими на конкретні ділянки хромосомної ДНК. Потім клонуйте sgRNA в масив CRISPR/Cas9 на плазміді. Після перетворення відповідних клітин інженерний CRISPR/Cas9 утворює комплекс з цільовими послідовностями ДНК. Після вирізання обох ниток цільової ДНК відновлення ДНК може вставити мутовані послідовності напрямних в цільову ДНК. Результатом є втрата або придбання послідовностей ДНК на конкретних точних ділянках або точне редагування генів. Саме здатність робити це в живих клітині порушила основні та клінічні дослідницькі спільноти.
• Перш ніж трансформувати клітини, спроектуйте генний масив CRISPR/Cas9 на плазміді, щоб усунути обидві активності ендонуклеази з білка Cas. Після транскрипції масиву в трансформованих клітині CRISPR/Cas9-sgRNA все ще знаходить ген, орієнтований на sgRNA. Однак, не маючи активності протеїнової ендонуклеази CAS, комплекс, який утворюється, просто сидить там, блокуючи транскрипцію. Цю методику іноді називають CRISPRi (CRISPER interference), за аналогією з РНІ. Застосовується до організмів (а не тільки in vitro або до клітин), він імітує набагато складніші експерименти з мутацією нокауту, які були використані в дослідженнях поведінки клітин або організмів, які виявилися нездатними експресувати конкретний білок.
• Зараз існує кілька робочих систем CRISPR/CAS, здатних до точного редагування генів. Вони захоплюють своєю швидкістю, точністю, перспективами швидкої, цільової генної терапії для боротьби з хворобами та їх можливостями змінювати цілі популяції (називається Gene Drive). Вставляючи модифіковані гени в зародкові клітини цільових організмів, генний привід може зробити нешкідливими цілі малярійні популяції комарів, усунути стійкість до пестицидів у, наприклад, комах, усунути стійкість до гербіцидів у небажаних рослин або генетично усунути інвазивні види. Для отримання додаткової інформації натисніть Gene Drive; для легкого читання про цей процес і суперечки навколо застосування CRISPR технологій для комарів, зокрема, перевірити Дж. Адлер, (2016) Світ без комарів. Смітсонівський, 47 (3) 36-42, 84.
• Можна навіть видалити цілу хромосому з клітин. Цей біт глобальної генної інженерії спирається на виявлення декількох унікальних послідовностей на одній хромосомі, а потім націлювання на ці сайти для CRISPR/CAS. Коли система активується, хромосома розрізається на цих ділянках, фрагментуючи її за межі здатності механізмів відновлення ДНК виправити ситуацію. Натисніть тут, щоб дізнатися більше.

Якщо ні з якої іншої причини, окрім його ефективності та простоти, точне редагування генів за допомогою методів CRISPR/CAS викликало етичні проблеми. Зрозуміло, що потенціал існує для зловживання або навіть для використання без корисної мети взагалі. Показово, що, як і в усіх обговореннях біологічної етики, вчені дуже багато займаються розмовою. Незважаючи на суперечки, ми, без сумніву, продовжимо редагувати гени за допомогою CRISPR/CAS, і ми можемо шукати найближчу майбутню Нобелівську премію за її відкриття та застосування! Якщо у вас все ще є труднощі, можливо, редагування РНК буде відповіддю. Ознайомтеся з посиланням на Навіщо редагувати РНК? для огляду можливостей!

Нарешті, «миші та чоловіки» (і жінки та діти теж) мають антитіла до білків Cas9, що свідчить про попередній вплив мікробних антигенів CRISPR/Cas9. Це спостереження може обмежити клінічне застосування технології! Дивіться невизначене майбутнє технології CRISPR-Cas9.

Малі РНК: miRNA та SiRNA у еукаріотів

Мікро РНК (miRNA) та малі інтерференційні РНК (SiRNA) знаходяться в C. elegans, невеликій нематоді (аскариди), яка швидко стала моделлю для досліджень клітинної та молекулярної біології та розвитку. Особливі пам'ятки C. elegans полягають у тому, що (а) його геном має ~ 21 700 генів, порівнянних з ~ 25 000 генами в геномі людини! ; (б) він використовує продукти цих генів для отримання дорослого хробака, що складається лише з 1031 клітин, організованих у всі основні органи, знайдені у вищих організмах; (c) Можна простежити ембріональне походження кожної окремої клітини в її організмі! C. elegans проілюстровано нижче.

1. Мала заважаюча РНК (SiRNA)

SirNA вперше був знайдений у рослин, а також у C. elegans. Однак sirNA (і miRNA) поширені у багатьох вищих організмів. sirNA були так названі, тому що вони перешкоджають функції інших РНК, чужорідних для клітини або організму. Їх дію охрестили інтерференцією РНК (РНК). За їх відкриття SirNAS, А.З. вогонь і К.Мелло розділили Нобелівську премію 2006 року з фізіології або медицини. Дія SiRNA, спрямованої на чужорідну ДНК, ілюструється нижче.

Коли клітини розпізнають чужорідні дволанцюгові РНК (наприклад, деякі геноми вірусної РНК) як чужорідні, DICER а нуклеаза називається гідролізує їх. Отримані короткі двониткові продукти гідролізу (SiRNaS) поєднуються з R NaI індукованим комплексом S Ilensing C, або білками RISC. Антисенс-ланцюг SiRNA в результуючому комплексі SirNA-RISC зв'язується з доповнюючими областями іноземних РНК, орієнтуючись на їх деградацію. Клітинне використання RISC для контролю експресії генів таким чином може бути похідним від використання білків RISC miRNA як частини клітинного захисного механізму, про який слід обговорити далі.

Спеціально розроблені SirNA були використані для відключення експресії конкретних генів з метою вивчення їх функції in vivo та in vitro. Як SirNA, так і мікроНК досліджуються як можливі терапевтичні інструменти для втручання в РНК, експресія яких призводить до раку чи інших захворювань.

234 SirNA повідомлення Транскрибаційного регулювання

235 Чи використовувала стратегію RISC SirNA для сміття корумпованої або зношеної РНК?

Для прикладу перегляньте відео Youtube про несподівані результати експерименту з РНК за цим посиланням. В описаному експерименті РНІ використовувався для блокування ембріональної експресії гена ортодентикули (odt), який зазвичай необхідний для росту рогів у гнойового жука. Ефект цієї мутації нокауту повинен був, як і очікувалося, запобігти зростанню рогу. Однак несподіваним було розвиток ока посередині голови жука («третє око» на мікрофотографії).

3-е око не тільки схоже на око, але є функціональним. Це було продемонстровано запобіганням нормального розвитку очей у мутантів ODT -нокауту. 3-е око з'явилося..., і було чуйним на світло! Майте на увазі, що це був жук з 3-м оком, а не дрозофіли! Цитуючи Джастіна Кумара з Університету Індіани, який, хоча і не брав участі в дослідженнях, заявив, що «... уроки, отримані з дрозофіли, можуть бути не настільки загальноприйнятними, як я чи інші дрозофілісти, хотів би вірити... Можливість використання РНІ в нетрадиційних модельних системах є величезним прогресом це, ймовірно, призведе до більш збалансованого погляду на розвиток».

2. Мікро РНК (miRNA)

МікроНК націлені на небажані ендогенні клітинні РНК для деграда Вони транскрибуються з генів, які зараз відомі широко поширені в еукаріот. Шляхи від транскрипції до мікроРНК через обробку та деградацію цільової мРНК проілюстрований на наступній сторінці.

Коли вони транскрибуються, попередньо MIRNA складаються в структуру стовбурової петлі, яка втрачається під час цитоплазматичної обробки. Як і SiRNA, зрілі мікроНК поєднуються з білками RISC. Комплекс RISC білково-міРНК націлений на старі або більше не потрібні мРНК або мРНК, пошкоджені під час транскрипції.

За оцінками, 250 miRNA у людей може бути достатньо для H-зв'язку з різноманітними цільовими РНК; тільки цілі з сильною комплементарністю до комплексу RISC білка-міРНК будуть деградовані.

236 мРНК після транскрипції регулювання

D. довгі некодуючі РНК

Довгі некодуючі РНК (LNCRNA) є ще одним класом еукаріотичних РНК. Вони включають стенограми антисенсової, інтронічної, інтергенної, псевдогенної та ретропозонної ДНК. Ретропозони - це один вид транспозон, або рухомий елемент ДНК; псевдогени - це впізнавані гени з мутаціями, які роблять їх нефункціональними. Хоча деякі LNCRNA можуть виявитися випадковими стенограмами, які клітина просто руйнує, інші відіграють роль у регулюванні експресії генів.

Нещодавно виявлена LNcRNA - це XiStar, яка, поряд з генним продуктом Xist, необхідна для формування тіл Барра. Тіла Барра утворюються у самок людини, коли одна з Х-хромосом в соматичних клітині інактивується. Огляд LNCRNA див. Лі, J.T. (2012. Епігенетична регуляція довгими некодуючими РНК; Наука 338, 1435-1439).

Ще більш пізня стаття (в LNCRNA та SmorFS) підсумовує відкриття, що деякі довгі некодуючі РНК містять короткі відкриті кадри читання (SMORF), які насправді перекладені на короткі пептиди 30+ амінокислот! Хто знає? Геном людини дійсно може містити більше 21 000-25 000 генів, кодуючих білок!

Е. кругові РНК (ЦирКРНК)

Хоча виявлені більше 20 років тому, кругові РНК (циркРНК) виготовляються в різних типах клітин еукаріотів. Натисніть Кругові РНК (CircRNA), щоб дізнатися більше про цей своєрідний результат альтернативного сплайсингу. Спочатку CIRCRNA було важко ізолювати. Коли вони були ізольовані, CircRNA містили «скрембльовані» екзонічні послідовності і тому вважалися нефункціональними помилками зрощування мРНК.

Насправді CircRNA досить стабільні. Їх рівні можуть підвищуватися і падати в закономірностях, що дозволяють припустити, що вони є функціональними молекулами Рівні однієї CircRNA, званої CirCrims1, підвищуються конкретно під час нервового розвитку. У мишей інші циркРНК накопичуються під час формування синапсу, що, ймовірно, впливає на те, як ці нейрони в кінцевому підсумку розвиватимуться та функціонуватимуть. Таким чином, CircRNA не здаються «молекулярними помилками». Насправді помилки у власному синтезі можуть співвідноситися з хворобою! Спекуляції про функції циркРНК також включають ролі в регуляції генів, особливо генів або мРНК, з яких вони самі походять.

Ф. «Небажана ДНК» в перспективі

Не так давно ми думали, що менше 5% еукаріотичного генома транскрибується (тобто в мРНК, рРНК та тРНК), і що більша частина геному, що не транскрибується, виконує структурну функцію... або взагалі ніякої функції. Остання, позначена небажаною ДНК, включала в себе неописувані інтергенні послідовності, псевдогени, «мертві» транспозони, довгі розтяжки інтронічної ДНК тощо Таким чином, небажана ДНК була ДНК, без якої ми могли обійтися. Небажані ДНК вважалися випадковими гонщиками в наших геномах, автостопщики підхопили на еволюційній дорозі.

Хоча гени miRNA є невеликою часткою еукаріотичного генома, їх відкриття та більш рясні РНК lnc свідчать про набагато більшу кількість функціональної ДНК в геномі. Чи може бути насправді, немає такого поняття, як «сміттєва ДНК»? Дискусія про те, скільки нашої геномної ДНК є пережитком минулих еволюційних експериментів і без генетичної мети триває. Читайте все про це в Junk DNA - не так марно зрештою, і лише 8,2% людської ДНК є функціональним.

Можливо, нам потрібно переосмислити, що означає ДНК бути «мотлохом» або бути без «генетичної мети». Підтримка більш ніж 90% нашої власної ДНК без відомої генетичної мети, безумовно, відбувається з витратами енергії. У той же час вся ця ДНК є сильною для майбутнього відбору, джерелом різноманітності, необхідної для тривалого виживання. Той самий природний відбір, який підбирає послідовності ДНК «автостопом», як ми бачили, може в якийсь момент змусити їх працювати!

G. РНК метилома

Назвіть це епі-транскриптом РНК, якщо вам подобається! Нагадаємо, що метильні групи пряме розщеплення рибосомних РНК з еукаріотичних 45S транскриптів перед РНК. ТРНК, серед інших стенограм, також є посттранскрипційно модифікованими. Відомі з 1970-х років такі модифікації вважалися нефункціональними. Але чи є вони?