9.3: Ремонт ДНК

A. Пошкодження ДНК (мутація) - це факт життя

Ми, як правило, приймаємо уявлення про те, що реплікація вірно дублює генетичний матеріал. У той же час еволюція була б неможлива без мутації, а мутація неможлива без хоча б якихось несприятливих наслідків.

Зародкові мутації є спадковими. При наявності в одному, але особливо в обох алелах гена, такі мутації можуть призвести до генетичного захворювання (наприклад, хвороба Тея-Саха, муковісцидоз, гемофілія, серповидноклітинна анемія тощо). Замість того, щоб викликати захворювання, деякі зародкові мутації можуть збільшити ймовірність захворіти (наприклад, мутації гена BRCA2 значно збільшують шанси жінки захворіти на рак молочної залози). Соматичні мутації в активно діляться клітині можуть призвести до доброякісних «кіст» або злоякісних пухлин (тобто раку). Інші соматичні мутації можуть відігравати певну роль у деменції (хвороба Альцгеймера) або в деяких нейропатологіях уздовж спектру аутизму.

Оскільки складна хімія реплікації піддається властивому високому показнику помилок, клітини розвинули системи відновлення ДНК, щоб вижити високі темпи мутації. Як ми бачили, самі ДНК-полімерази мають коректорську здатність, так що неправильно вставлені основи можна швидко видалити і замінити. Крім цього, кілька механізмів еволюціонували для відновлення неузгоджених пар основ та інших видів пошкодженої ДНК, які уникають раннього виявлення. Як часто і де відбувається пошкодження ДНК, є випадковим, як і які пошкодження будуть відновлені, а які втечуть, щоб стати мутацією. Для тих, хто страждає жахливими наслідками невідновленої мутації, балансом між збереженою та відновленою ДНК, пошкодженням є найменше, недосконалим. Однак еволюція і продовження самого життя покладаються на цей баланс.

Б. що спричиняє пошкодження ДНК

ДНК найбільш схильна і тому найбільш вразлива до пошкоджень, особливо у еукаріотів. Найпростішим пошкодженням ДНК під час реплікації є точкова мутація, випадкове введення «неправильного» нуклеотиду у зростаючу нитку ДНК. Інші мутації, однаково випадкові, включають видалення ДНК, дублювання, інверсії тощо, будь-яка з яких може уникнути ремонту. Причини пошкодження ДНК можуть бути хімічними або фізичними, і включають спонтанні внутрішньоклітинні події (наприклад, окислювальні реакції) та фактори навколишнього середовища (радіація, екзогенні хімічні речовини тощо). Грунтуючись на дослідженнях різних видів пошкодження ДНК, Томас Ліндал підрахував, що події, що пошкоджують ДНК, можуть відбуватися зі швидкістю 10,000 на день! Ліндаль зрозумів, що повинні бути деякі «фундаментальні механізми відновлення ДНК» для захисту клітин від такої високої швидкості пошкодження ДНК. Відкриття механізму ремонту базового висічення принесло Томасу Ліндалю частку в 2015 році Нобелівської премії з хімії. Фактори навколишнього середовища, які можуть пошкодити ДНК, включають ультрафіолетове світло, рентгенівські промені та інше випромінювання, а також хімічні речовини (наприклад, токсини, канцерогени і навіть наркотики тощо). Можуть вражатися як зародкові, так і соматичні клітини. Хоча мутації можуть і викликають часто виснажливі захворювання, повчально тримати вплив мутацій в перспективі. Більшість мутацій насправді мовчать; вони не викликають хвороби. Крім того, відновлюється значне пошкодження ДНК. Клітини коригують понад 99,9% помилкових змін бази, перш ніж у них з'явиться шанс стати мутаціями. Ось чому ми вважаємо реплікацію «вірним» процесом. Давайте розглянемо деякі поширені типи пошкодження ДНК, які зазвичай ремонтуються:

• Піримідинові димери, характерні для сусідніх тимінів (рідше цитозинів) в одній ланцюжку ДНК, викликані УФ-впливом
• Депуринація; гідролітичне видалення гуаніну або аденіну з #1 C (вуглецю) дезоксирибози в ланцюжку ДНК
• Дезамінація: гідролітичне видалення аміногруп (-NH2) з гуаніну (найбільш поширеного), цитозину або аденіну
• Окислювальне пошкодження дезоксирибозою з будь-якою основою, але найчастіше пуринами
• Невідповідне метилювання будь-яких підстав, але найчастіше пуринів
• Обрив ланцюга ДНК під час реплікації або від радіаційного або хімічного впливу

C. деякі молекулярні наслідки невиправленого пошкодження ДНК

Хоча бактерії зазнають пошкодження ДНК, ми зосередимося тут на еукаріотах, оскільки вони розвинули найскладніші механізми. Пам'ятайте, що невідновлене пошкодження ДНК буде передано дочірнім клітинам при мітозі або може бути передано наступному поколінню, якщо мутація відбудеться в зародковій клітині.

Далі розглянемо деякі молекулярні наслідки нескорректированного пошкодження ДНК.

1. Депуринація

Це спонтанне гідролітичне видалення гуаніну або аденіну з дезоксирибози C #1 в ланцюжку ДНК. Його частота 5000 депуринацій на клітину в день підкреслює високу швидкість пошкодження ДНК, що вимагає виправлення! Якщо не відремонтувати, депуринація призводить до елеції однієї пари основи в одній хромосомі після реплікації, залишаючи ДНК в тій же області іншої хромосоми без змін. Ефекти депуринації проілюстровані нижче.

Реплісома ігнорує відсутню базу під час реплікації депуринованої області ДНК (A в цьому прикладі), переходячи до С в депуринованій ДНК шаблону. Невідремонтована, одна нова дволанцюгова ДНК матиме видалення, залишивши іншу нову без мутації.

2. піримідинова димеризація

Експозиція ДНК ультрафіолетовим світлом може призвести до димеризації сусідніх піримідинів (зазвичай тимінів; рідше цитозини) на ланцюжку ДНК. Піримідинові димери утворюються зі швидкістю трохи менше 100 на клітину на добу!

Невиправлена димеризація призводить до 2-базисної делеції в одній хромосомі, тоді як інша незмінна (нижче).

Ви можете передбачити, що корекція цього випромінювання індукованого пошкодження буде або включати порушення димерів (в даному випадку тимінових димерів), або видалення та заміну димеризованих баз мономерними базами.

3. Демінація

Дезамінація - це гідролітичне видалення аміногруп (-NH2) з гуаніну (найбільш поширеного), цитозину або аденіну зі швидкістю 100 на клітину на добу. Дезамінація не впливає на тимін (тому що він не має —аміногруп!). Невиправлена дезамінація призводить до заміщення бази на одній хромосомі (насправді, заміщення пари T-A на вихідну C-G в цьому прикладі) і не змінює іншу. Дезамінація аденіну або гуаніну призводить до виникнення неприродних підстав (гіпоксантин і ксантин відповідно). Вони легко розпізнаються та коригуються системами відновлення ДНК. Базова пара U-A іноді залишається невідремонтованою. Наслідки дезамінації на базову послідовність наведені нижче.

D. Механізми відновлення ДНК

Багато ферментів і білків беруть участь в репарації ДНК. Деякі з них функціонують при нормальній реплікації, мітозі та мейозі, але були кооптизовані для заходів з відновлення ДНК. Ці молекулярні кооптації настільки життєво важливі для нормальної функції клітин, що деякі ремонтні заходи та молекулярні гравці дуже збережені в еволюції. Серед різних шляхів відновлення ДНК, які були ідентифіковані, ми розглянемо відновлення базового висічення, відновлення висічення нуклеотидів, відновлення зв'язку з транскрипцією, негомологічне кінцеве приєднання та гомологічну рекомбінацію (з них останнє мабуть, найскладніший).

1. Ремонт висічення бази

При виявленні та розпізнаванні неправильного підстави (наприклад, окислених підстав, відкритих основ, дезамінованих Cs або As, основ, що містять зв'язки C = C, насичені C-C зв'язками...), специфічні глікозилази ДНК каталізують гідроліз пошкодженої основи з ураженої дезоксирибози в ДНК. Щоб дізнатися більше про конкретні версії цього ферменту, натисніть тут. Події ремонту висічення бази підсумовані нижче.

Після того, як ДНК-глікозилаза видаляє порушувальну основу, ендонуклеаза AP розпізнає дезоксирибозу з відсутньою основою і ніксує ДНК у цього нуклеотиду. Наступний фосфодіестераза гідролізує залишок фосфат-ефіру зв'язку «без основи» фосфату цукру, видаляючи його з ланцюга ДНК. ДНК-полімераза потім додає правильний нуклеотид до 3' кінця ніка. Нарешті, ДНК-лігаза III (АТФ-залежна версія ссавців вихідного прокаріотичного ферменту) ущільнює залишився нік в нитку. Томас Ліндал (див. Вище) відкрив більшість цих ферментів.

2. Ремонт висічення нуклеотидів

Відкриття ремонту висічення нуклеотидів принесло Азізу Санкару частку в 2015 році Нобелівської премії з хімії. До результатів цього механізму відносять видалення тимідинових димерів. Події відновлення висічення нуклеотидів показані нижче для піримідинового димера.

У цьому прикладі висічення нуклеази розпізнає піримідиновий димер і гідролізує фосфодіефірні зв'язки між нуклеотидами на декількох підставах від обох сторін димера. Потім спіраль ДНК розкручується і відокремлює фрагмент ДНК, що містить димеризовані основи, від пошкодженої ланцюга ДНК. Нарешті, ДНК-полімераза діє 5'-3', щоб заповнити прогалину, а ДНК-лігаза ущільнює решту нік, щоб завершити ремонт.

3. Невідповідність Ремонт

Відновлення невідповідності ДНК відбувається, коли коректура ДНК-полімерази пропускає неправильну вставку основи в нову нитку ДНК. Цей механізм відновлення спирається на те, що дволанцюгова ДНК показує специфічну картину метилювання. Відкриття механізму ремонту невідповідності принесло Полу Модріху частку в Нобелівській премії 2015 року з хімії. Ці схеми метилювання пов'язані з епігенетичними закономірностями активності генів та хромосомною структурою, які, як очікується, успадковуються дочірніми клітинами. Коли ДНК реплікується, метильні групи на шаблоні ДНК ниток залишаються, але знову синтезована ДНК неметильована. Насправді, це займе деякий час, щоб ферменти метилювання знайшли та метилювали відповідні нуклеотиди в новій ДНК. У проміжний час кілька білків та ферментів можуть виявити невідповідне сполучення основи (невідповідності) та ініціювати відновлення невідповідності. Основний процес проілюстрований нижче.

4. Транскрипція в поєднанні Ремонт (в Еукаріотів)

Якщо РНК-полімераза, що читає ДНК шаблону, зустрічається з шаблоном або шаблоном із незвичною базовою заміною, це може зупинити транскрипцію і «не знати, що робити далі». Таким чином, у збиток звичайна розшифровка не буде зроблена, і клітина може не вижити. Немає великої справи в тканині, що складається з тисяч, якщо не мільйонів клітин, чи не так? Тим не менш, Транскрипція в поєднанні Ремонт існує! У цьому шляху відновлення, якщо РНК-полімераза зіткнеться з ураженням ДНК (тобто пошкодженою ДНК) під час транскрибування шаблонної нитки, вона дійсно застопориться. Це дозволяє час для з'єднання білків досягти застопорилася полімерази і дозволяє ремонтним машинам (наприклад, шляхом висічення основи або нуклеотидів), щоб здійснити ремонт. Після завершення ремонту РНК-полімераза «резервна копія» вздовж шаблонної нитки за допомогою інших факторів і відновлює транскрипцію виправленого шаблону.

5. Негомологічне кінцеве з'єднання

Помилки реплікації ДНК можуть спричинити подвійні багатониткові розриви, як і фактори навколишнього середовища (іонізуюче випромінювання, окислення тощо). Ремонт за допомогою негомологічного кінцевого з'єднання видаляє пошкоджену та сусідню ДНК та знову приєднується до «зрізаних» кінців (показано нижче).

Після того, як місце дволанцюгового розриву розпізнається, нуклеотиди, гідролізовані з кінців обох ниток на місці розриву, залишають «тупі кінці». Далі кілька білків (Ку серед інших) зводять нитки ДНК разом і додатково гідролізують окремі нитки ДНК, щоб створити шахові (перекриваються або доповнюють) кінці. Перекриваються кінці цих ниток ДНК утворюють Н-зв'язки. Нарешті, ДНК-лігаза ущільнює H-зв'язані перекриваються кінці ниток ДНК, залишаючи ремонт з видаленими основами.

У людей похилого віку є докази більш ніж 2000 «слідів» такого роду ремонту на клітину. Як це можливо? Це швидке виправлення часто працює без негативних наслідків, оскільки більшість еукаріотичного генома не кодує гени або навіть регуляторну ДНК (пошкодження яких інакше було б більш серйозним).

6. гомологічна рекомбінація

Гомологічна рекомбінація - складна, але нормальна і часта частина мейозу у еукаріотів. Ви можете згадати, що гомологічна рекомбінація виникає при синапсі при першому клітинному поділі мейозу (Мейоз I). Під час синапсису вирівнюються гомологічні хромосоми. Це може призвести до розриву ДНК, обміну алелями та перев'язки для повторної герметизації тепер рекомбінантних молекул ДНК. Нові рекомбінації варіантних алелей в хромосомах сперматозоїдів та яйцеклітин забезпечують генетичне різноманіття видів. Ключовим моментом є те, що для обміну алелями між гомологічними хромосомами необхідний розрив ДНК. Зверніться до глави генетики у вступному підручнику з біології, або розділ рекомбінації в генетичному тексті, щоб нагадати про ці події.

Клітини використовують один і той же механізм для повторного герметизації розривів ДНК під час нормальної рекомбінації та відновлення ДНК, пошкодженої одним або подвійним багатонитковим розривом. Одна нитка ДНК, вирізана під час реплікації, може бути відремонтована рекомбінацією з нитками гомологічної ДНК, які реплікуються на іншій нитці. Подвійний багатожильний розрив можна відремонтувати за допомогою того ж рекомбінаційного обладнання, яке працює на сестринських хроматидах при мейозі. В обох випадках процес точно відновлює пошкоджену ДНК без будь-яких видалень. Ці механізми зберігаються в клітині всіх видів. Це вказує на еволюційний імператив точного відновлення виживання видів, не менше, ніж імператив підтримувати генетичне різноманіття видів.

а) Ремонт одножильного розриву

Конкретним прикладом гомологічного рекомбінаційного відновлення є відновлення реплікаційної вилки, пошкодженої, коли реплісома досягає розриву в одному з двох ниток реплікації ДНК (ілюстровано нижче).

Такий розрив, можливо, стався до самої реплікації, і ремонт починається, коли вилка реплікації (РФ) досягає ураження. На першому кроці екзонуклеаза 5'-3' обрізає шаблонну ДНК назад вздовж свого нового синтезованого комплементу. Далі мономери білка ReCa (кожен з декількома сайтами зв'язування ДНК) зв'язуються з одноцепочечной ДНК, утворюючи нуклеопротеїнову нитку. За допомогою додаткових білків 3' кінець «нитки» сканує «іншу» реплікуючу нитку для гомологічних послідовностей. Коли такі послідовності знайдені, нитка Reca-ДНК зв'язується з гомологічними послідовностями, і нитка нової ДНК «вторгається» в гомологічну (тобто протилежну) подвійну багатониткову ДНК, розділяючи її шаблон і знову репліковану ДНК. Після вторгнення пасма, реплікація провідного пасма триває від 3' кінця вторгнення пасма. Новий РФ встановлюється, оскільки шаблон провідної нитки порушується і перелігується до початкового розриву; Нова відстаюча реплікація нитки потім відновлюється на новому (повторно побудованому) РФ. Результатом є точне відновлення початкового пошкодження, без видалення або вставки ДНК.

ReCa, бактеріальний білок, є ще одним із тих еволюційно збережених білків. Його гомолог в Археї називається РАДА. У еукаріотів гомолог називається Rad51, де він ініціює синапсис під час мейозу. Таким чином, здається, що роль ReCa та його збережених гомологів у відновленні ДНК передувала його використанню в синапсисі та перетині у еукаріотів! Щоб дізнатися більше про функції протеїну ReCa та його гомологів, натисніть тут.

б) Ремонт двожильного розриву

Гомологічна рекомбінація також може відновити дволанцюговий розрив ДНК за допомогою ряду ферментів та інших білків. Альтернативні шляхи ремонту узагальнено на ілюстрації на наступній сторінці. Ось список білків, які беруть участь у цих гомологічних рекомбінаційних шляхах:

MRX, MRN: зв'язувати при двожильному розриві; набирати інші фактори.

Sae2: ендонуклеаза (активна при фосфорилірованіі).

SGS1: спіраль.

Exo1, Dna2: однониткові екзонуклеази.

RPA, Rad51, DMC1: білки, які зв'язуються з нависаючою ДНК, утворюючи нуклеопротеїнову нитку та ініціюють вторгнення ниток при подібних послідовностях.

Виявлено діяльність інших ферментів на кресленні. На цій ілюстрації не показані два генні продукти, які взаємодіють з деякими білками, які опосередковують шлях відновлення. Це продукти генів BRCA1 і BRCA2 (ті ж самі, що при мутації підвищують ймовірність того, що жінка захворіла на рак молочної залози). Виражаючись переважно в тканині молочної залози, їх генні продукти дикого типу (нормальні) беруть участь у гомологічному рекомбінаційному відновленні дволанцюгових розривів ДНК. Вони роблять це шляхом прив'язки до Rad51 (людський гомолог ReCa!).

При мутації білки BRCA погано функціонують, а ДНК в уражених клітині недостатньо ефективно відновлюється. Це ймовірна основа підвищеного шансу захворіти на рак молочної залози. Це не допомагає важливо, що нормальний білок BRCA1 також відіграє роль у відновленні невідповідності... і що мутований білок не може! Щоб закінчити цю главу, ось трохи дивної науки! Прочитайте все про геном тварюки, майже 17% з яких складається з чужорідної ДНК, можливо, результат тут.