9.2: Реплікація ДНК
- Page ID
- 6144
Як ми бачили, нитки ДНК мають спрямованість, з 5' нуклеотид-фосфат і 3' дезоксирибозний гідроксильний кінець. Це навіть справедливо для кругових бактеріальних хромосом..., якщо коло розірвано! Оскільки пасма подвійної спіралі є антипаралельними, 5' кінець однієї пасма вирівнюється з 3'кінцем іншої на обох кінцях подвійної спіралі. Додаткове спарювання основ в ДНК означає, що базова послідовність однієї нитки може бути використана як шаблон для створення нової доповнюючої пасма. Як ми побачимо, ця структура ДНК створила цікаві дилеми для розуміння біохімії реплікації. Здивування навколо того, як відбувається реплікація, починається з експериментів, які візуалізують реплікацію ДНК.
A. Візуалізація реплікації та реплікації вилок
Нагадаємо, явище бактеріальної кон'югації дозволило демонструвати бактеріальні хромосоми були круговими. У 1963 році Джон Кернс підтвердив цей факт безпосередньою візуалізацією бактеріальної ДНК. Він культивував клітини кишкової палички протягом тривалого періоду на 3Hthymidine (3H-T), щоб зробити всю їх клітинну ДНК радіоактивною. Потім він м'яко порушив клітини, щоб мінімізувати пошкодження ДНК. Вивільненої ДНК дозволили осісти і прилипати до мембран. Поверх мембрани була поміщена чутлива плівка, і було дозволено час для випромінювання, щоб оголити плівку. Після того, як Кернс розробив авторентгенографи, він вивчив результати в електронному мікроскопі. Він бачив сліди срібних зерен в авторадіографах (той самий вид срібних зерен, які створюють зображення на плівці в старомодній фотографії). Подивіться на два креслення його авторадіографів на наступній сторінці.
Кернс вимірював довжину «срібних» доріжок, які зазвичай складалися з трьох можливих замкнутих петель, або кіл. Окружності двох цих кіл завжди були рівними, їх довжина близько передбачалася вмістом ДНК однієї, що не ділиться клітини. Тому Кернс інтерпретував ці зображення як бактеріальну ДНК в процесі реплікації. Авторадіографи Кернса та вимірювання, які привели його до висновку, що він дивився на зображення бактеріальних кругових хромосом, проілюстровані нижче.
Він розташував свої зображення авторадіографа в послідовності (нижче), щоб зробити свою точку зору.
Тому що реплікуються хромосоми виглядали (смутно!) як грецька буква \(\theta\), Кернс називав їх тета-образами. Він зробив висновок, що реплікація починається при єдиному походженні реплікації на бактеріальній хромосомі, протікаючи по колу до завершення.
Подальші експерименти Девіда Прескотта продемонстрували двонаправлену реплікацію..., що реплікація дійсно почалася у походження реплікації, після чого подвійна спіраль була розмотана і відтворена в обох напрямках, подалі від витоків, утворюючи дві вилки реплікації (ілюстровано нижче).
176 Напівконсервативна бірекційна реплікація з двох RF
Бактеріальні клітини можуть ділитися щогодини (або навіть менше); швидкість синтезу бактеріальної ДНК становить близько 2 Х 106 пар основ на годину. Типове ядро еукаріотичної клітини містить в тисячі разів більше ДНК, ніж бактерія, а типові еукаріотичні клітини подвоюються кожні 15-20 годин. Навіть невелика хромосома може містити в сотні або тисячі разів більше ДНК, ніж бактерія. Виявилося, що еукаріотичні клітини не можуть дозволити собі подвоїти свою ДНК при бактеріальній швидкості реплікації! Еукаріоти вирішили цю проблему не шляхом розвитку більш швидкої біохімії реплікації, а шляхом використання множинних джерел реплікації, з яких синтез ДНК протікає в обох напрямках. Це призводить до створення декількох реплікон.
Кожна репліка збільшується, врешті-решт зустрічаючи інші зростаючі реплікони з обох сторін, щоб повторити більшу частину кожної лінійної хромосоми, запропонованої на ілюстрації нижче.
Перш ніж детально розглянути біохімічні події на вилках реплікації, давайте розглянемо роль ферментів ДНК-полімерази в цьому процесі.
B. ДНК-полімерази каталізують реплікацію
Перший з цих ферментів був відкритий в кишковій паличці Артуром Корнбергом, за що він отримав Нобелівську премію з хімії 1959 року. Томас Корнберг, один з синів Артура, пізніше знайшов ще дві ДНК-полімерази! Всі ДНК-полімерази вимагають шаблонної нитки, проти якої синтезувати нову комплементарну нитку. Всі вони вирощують нову ДНК, додаючи до 3-дюймового кінця зростаючого ланцюга ДНК в послідовних реакціях конденсації. І нарешті, всі ДНК-полімерази також мають дивну властивість, що вони можуть додавати лише до вже існуючої нитки нуклеїнової кислоти, піднімаючи питання про те, звідки береться «існуюча» нитка! ДНК-полімерази каталізують утворення зв'язку фосфодіефіру між кінцем зростаючої нитки і вхідним нуклеотидом, доповнюючим шаблонної ниткою. Енергія для утворення зв'язку фосфодіефіру частково надходить від гідролізу двох фосфатів (пірофосфату) з вхідного нуклеотиду в процесі реакції. Хоча реплікація вимагає участі багатьох ядерних білків як у прокаріотах, так і в еукаріотах, ДНК-полімерази виконують основні етапи реплікації, як показано на ілюстрації нижче.
178 ДНК-полімераз та їх діяльність
Хоча ДНК-полімерази реплікують ДНК з високою вірністю з лише однією помилкою на 107 нуклеотидів, помилки трапляються. Коректурна здатність деяких ДНК-полімераз виправляє багато з цих помилок. Полімераза може відчувати невідповідну базову пару, сповільнювати, а потім каталізувати повторні гідролізи нуклеотидів, поки не досягне невідповідної базової пари. Ця основна коректура за допомогою ДНК-полімерази показана нижче.
Після відновлення невідповідності ДНК-полімераза відновлює рух вперед. Звичайно, не всі помилки вловлюються тим чи іншим механізмами ремонту (див. DNA Repair, нижче). Мутації в клітині статевої лінії еукаріот, які вислизають від корекції, можуть спричинити генетичні захворювання. Однак більшість - це мутації, які підживлюють еволюцію. Без мутацій в клітині статевої лінії (яйцеклітина і сперма) не було б мутацій і еволюції, а без еволюції саме життя зайшло б у швидкий глухий кут! Інші помилки реплікації можуть генерувати мутації соматичних клітин. Якщо ці соматичні мутації уникнути корекції, вони можуть мати серйозні наслідки, включаючи генерацію пухлин і ракових захворювань.
C. процес реплікації
Реплікація ДНК - це послідовність повторних реакцій конденсації (синтезу зневоднення), що зв'язують нуклеотидні мономери в полімер ДНК. Як і всі біологічні полімеризації, реплікація протікає в трьох ферментативно каталізованих і скоординованих етапах: ініціювання, подовження і припинення.
1. Ініціація
Як ми бачили, синтез ДНК починається з одного або декількох джерел або реплікації. Це послідовності ДНК, орієнтовані на білки-ініціатори в кишковій паличці (нижче).
Після розриву водневих зв'язків у походження реплікації подвійна спіраль ДНК прогресивно розпаковується в обох напрямках (тобто шляхом двонаправленої реплікації). Відокремлені нитки ДНК служать шаблонами для нового синтезу ДНК. Послідовності у походження реплікації, які зв'язуються з білками ініціації, як правило, багаті аденіном та тиміновими основами. Це пов'язано з тим, що базові пари A-T мають дві водневі (H-) зв'язки, які вимагають менше енергії для розриву, ніж три H-зв'язки, що тримають пари G-C разом. Після того, як білки ініціації розпушують H-зв'язки при реплікації походження, ДНК helicase використовує енергію гідролізу АТФ для розмотування подвійної спіралі. ДНК-полімераза III є основним ферментом, який потім подовжує нову ДНК. Після початку реплікації міхур (реплікація) утворюється як повторювані цикли подовження протікають на протилежних вилах реплікації.
Нагадуючи, що нові нуклеотиди можна додавати лише до вільної 3' гідроксильної групи вже існуючої нуклеїнової кислоти. Оскільки жодна відома ДНК-полімераза не може почати синтезувати нові нитки ДНК з нуля, це проблема! Тому дія ДНК-полімераз вимагає праймера, нитка нуклеїнової кислоти, до якої можна додати нуклеотиди. Питання були..., що таке грунтовка і звідки вона береться? Оскільки РНК-полімерази (ферменти, які каталізують синтез РНК) є єдиною нуклеотидною полімеразою, яка може виростити нову нитку нуклеїнової кислоти проти шаблону ДНК з нуля (тобто з першої основи), було припущено, що РНК може бути праймером, Після синтезу короткого праймера РНК, новий дезоксинуклеотиди будуть додані до його 3' кінця ДНК-полімеразою. Відкриття коротких відрізків нуклеотидів РНК на 5' кінці фрагментів Окадзакі підтвердило поняття праймерів РНК. Тепер ми знаємо, що клітини використовують примазу, спеціальну РНК-полімеразу, активну під час реплікації, щоб зробити ці РНК праймери проти шаблонів ДНК, перш ніж ДНК-полімераза зможе виростити нитки ДНК на вилках реплікації. Як ми побачимо зараз, вимога до праймерів РНК більше ніде не є доказом у подіях на вилці реплікації.
2. Подовження
Дивлячись на подовження на одній вилці реплікації (нижче), ми бачимо ще одну проблему:
Один з двох нових ниток ДНК може постійно рости до вилки реплікації, коли подвійна спіраль розкручується. А як щодо іншої пасма? Або ця інша пасмо повинна рости шматками в протилежному напрямку, або вона повинна чекати, щоб почати синтез, поки подвійна спіраль не буде повністю розкручена. Якщо одна нитка ДНК повинна бути відтворена фрагментами, то ці фрагменти доведеться зшивати (тобто перев'язати) разом. Проблема проілюстрована нижче.
Згідно з цією гіпотезою, нова провідна нитка ДНК постійно подовжується шляхом послідовного додавання нуклеотидів до її 3' кінця проти шаблону провідного нитка. Інша нитка, однак, буде виготовлена шматками, які будуть з'єднані в зв'язку фосфодіефіру в подальшій реакції. Через додатковий крок і, мабуть, додатковий час, необхідний для створення та приєднання цих нових фрагментів ДНК, ця нова ДНК називається відстаючою ниткою, що робить її шаблон відстаючим шаблоном нитки.
Рейдзі Окадзакі та його колеги вивчали мутантів фагів Т4, які повільно росли в клітинах-господарях кишкової палички. Вони намалювали темпи росту дикого типу та мутантного фага Т4 і продемонстрували, що повільний ріст був обумовлений дефіцитом ферменту лігази ДНК, який вже відомий каталізацією циркуляризації молекул лінійної фагової ДНК, що відтворюються в інфікованих клітинах-господарях. На графіку нижче підсумовуються їх результати.
Гіпотеза Окадзакі полягала в тому, що дефіцит ДНК лігази в мутантному фазі не тільки сповільнював циркуляризацію реплікації ДНК Т4 фагів, але також буде повільним при приєднанні фрагментів ДНК фагів, реплікованих принаймні проти одного з двох шаблонів ДНК ниток. Коли гіпотеза була перевірена, Оказакіс виявив, що короткі фрагменти ДНК дійсно накопичуються в клітині кишкової палички, інфікованих мутантами з дефіцитом ліг, але не в клітині, заражених фагом дикого типу. Відстаючі фрагменти нині називають фрагментами Окадзакі.
180 Експерименти та фрагменти Окадзакі - Рішення проблеми на РФ
181 Фрагменти Окадзакі зроблені починаючи з РНК-праймерів
Ви можете перевірити оригінальні дослідження Окадзакі за цим посиланням.
Кожен фрагмент Окадзакі повинен був би починатися з 5' РНК грунтовки, створюючи ще одну дилему! Праймер РНК повинен бути замінений дезоксинуклеотидами перед зшиванням фрагментів між собою. Це насправді відбувається, і процес проілюстрований нижче
Видалення нуклеотидів праймера РНК з фрагментів Оказалі вимагає дії ДНК-полімерази I, ферменту, який також може каталізувати гідроліз фосфодіефірних зв'язків між нуклеотидами РНК (або ДНК) з 5'-кінця нитка нуклеїнової кислоти. Клапоть Endonuclease 1 (FEN 1) також відіграє роль у видаленні «клаптів» нуклеїнової кислоти з 5' кінців фрагментів часто зміщуються полімеразою, оскільки вона замінює праймер реплікації. Одночасно з видаленням нуклеотидів РНК ДНК-полімераза I каталізує їх заміну відповідними дезоксинуклеотидами. Нарешті, коли фрагмент повністю ДНК, ДНК-лігаза пов'язує його з рештою вже зібраної відстаючої нитки ДНК. Через свою 5' екзонуклеазну активність (не зустрічається в інших ДНК-полімеразах), ДНК-полімераза 1 також відіграє унікальну роль у відновленні ДНК (розглянуто далі нижче). Як запропонував Керн та інші продемонстрували, реплікація протікає у двох напрямках від походження, щоб сформувати реплікон з двома вилами реплікації (RF). Кожен РФ має примазу, пов'язану з реплікацією фрагментів Окадзакі уздовж відстаючих шаблонів ниток.
Як запропонував Керн та інші продемонстрували, реплікація протікає у двох напрямках від походження, щоб сформувати реплікон з двома вилами реплікації (RF). Кожен РФ має примазу, пов'язану з реплікацією фрагментів Окадзакі уздовж відстаючих шаблонів ниток.
Вимога до примаз на реплікаційних вилах наведено нижче.
Тепер ми можемо запитати, що відбувається, коли реплікони досягають кінців лінійних хромосом у еукаріотів.
3. Припинення
У прокаріотів реплікація завершена, коли дві вилки реплікації зустрічаються після реплікації їх частини кругової молекули ДНК. У еукаріотів багато репліконів зливаються, щоб стати більшими репліками, врешті-решт досягаючи кінців хромосом..., де є ще одна проблема (нижче)!
Коли реплікон наближається до кінця хромосоми (тобто дволанцюгової молекули ДНК), синтезована ланцюг безперервно зупиняється, коли досягає 5' кінця своєї шаблонної ДНК. Теоретично синтез останнього фрагмента Окадзакі може бути загрунтований з 3' кінця відстаючої шаблонної нитки. Ілюстрація вище передбачає видалення праймера з передостаннього фрагмента Окадзакі і каталізованої заміни ДНК-полімерази нуклеотидами ДНК. Але як щодо останнього фрагмента Окадзакі? Чи буде його грунтовка гідролізована? Більше того, без вільного 3' кінця додати, як ці нуклеотиди РНК замінені нуклеотидами ДНК? Проблема тут полягає в тому, що кожен раз, коли клітина реплікується, одна нитка нової ДНК (ймовірно, обидві) буде ставати коротшою і коротшою. Звичайно, цього б не зробила..., і не буває! Еукаріотична реплікація проходить процес припинення, що включає розширення довжини однієї з двох ниток ферментом теломеразою. Дія теломерази узагальнено на ілюстрації нижче
Теломераза складається з декількох білків і РНК. З малюнка компонент РНК служить шаблоном для розширення проблемної нитки ДНК 5'-> 3'. Білок з необхідною активністю зворотної транскриптази називається The lomerase R зворотної T транскриптази, або TERT. The The Ломераза R NA C компонент називається TERC. Керол Грейдер, Джек Состак та Елізабет Блекберн поділилися Нобелівською премією 2009 року з фізіології та медицини за виявлення теломерази.
183 Реплікація теломерази запобігає скороченню хромосом https: //youtu.be/m4dmfrxgkku
Одним з найбільш цікавих останніх спостережень було те, що диференційовані, що не діляться клітини більше не виробляють фермент теломерази. З іншого боку, гени теломерази активні в нормальних ділильних клітині (наприклад, стовбурових) і ракових клітині, які містять велику кількість теломерази.
4. Чи є реплікація процесивним?
Малюнки репліконів і вилок реплікації припускають окремі події на кожній нитці ДНК. І все ж події на реплікаційних вилках, здається, скоординовані. Реплікація може бути процесивною, тобто обидва нові нитки ДНК відтворюються в одному напрямку одночасно, згладжуючи процес. Як це може бути можливо? На малюнку нижче показаний відстаючий шаблон нитки згинання ДНК, так що він звернений в тому ж напрямку, що і провідна нитка на вилці реплікації.
Реплісомна структура, карикатувана на вилці реплікації, складається з білків затиску, примази, хелікази, ДНК-полімерази та одноланцюгових зв'язуючих білків серед інших.
Нові методи візуалізації реплікації за допомогою флуоресцентної відеозйомки в режимі реального часу називають процессивну модель під сумнів, припускаючи, що процес реплікації нічого, крім гладкого! Чи відстаюча і провідна реплікація нитки насправді не скоординована? Крім того, чи є ривковий рух подовження ДНК у відео артефактом, так що модель плавної, скоординованої реплікації, інтегрованої в реплісомі, все ще діє? Або координація визначається і досягається якимось іншим способом? Перевірте відео самостійно в статті тут.
5. Ще одна проблема з реплікацією
Кернс записав багато зображень E.coli такого роду, як показано нижче.
Спіральний, скручений вигляд тиражуються кіл інтерпретувався як природний наслідок спроби розірвати спірально переплетені нитки ДНК... або переплетені нитки будь-якого матеріалу! У міру того, як нитки продовжували розкручуватися, ДНК повинна скручуватися в суперкотушку ДНК. Збільшення розмотування ДНК призведе до розриву фосфодіефірних зв'язків у ДНК, фрагментуючи ДНК. Очевидно, що цього не відбувається. Експерименти були розроблені для демонстрації супернамотування та перевірки гіпотез, що пояснюють, як клітини розслабляють суперкотушки під час реплікації. Тестування цих гіпотез виявило ферменти топоізомерази. Ці ферменти зв'язуються і утримуються за ДНК, каталізують гідроліз фосфодіефірних зв'язків, контролюють розмотування подвійної спіралі і, нарешті, каталізують повторне утворення зв'язків фосфодіефіру. Важливо зазначити, що топоізомерази не є частиною реплісоми, але можуть діяти далеко від вилки реплікації, ймовірно, реагуючи на напругу в перемотаній ДНК. Нагадаємо, що топоізомерази містять значну частину білка, що лежить уздовж еукаріотного хроматину.
185 топоізомерази полегшують супернамотування під час реплікації
Ми розглянули більшість молекулярних гравців у реплікації. Нижче наведено список ключових білків реплікації та їх функцій (звідси).
| Фермент | Функція в реплікації ДНК |
| ДНК Хеліказа | Також відомий як спіраль дестабілізуючий фермент. Розмотує подвійну спіраль ДНК на вилці реплікації. |
| ДНК-полімераза |
Створює нову дуплексну ланцюг ДНК, додаючи нуклеотиди в напрямку від 5 до 3'. Також виконує коректуру і виправлення помилок. |
| ДНК-затискач | Білок, який запобігає дисоціації ДНК-полімерази III від материнської нитки ДНК. |
| Однониткові зв'язуючі (SSB) білки | Зв'язуйтеся з SSDNA і запобігайте повторному відпалу подвійної спіралі ДНК після того, як спіраль ДНК розмотує її, підтримуючи поділ нитки. |
| топоізомераза | Розслаблює ДНК від її супер-згорнутої природи. |
| ДНК-гіраза | Знімає деформацію розмотування за допомогою ДНК helicase; це специфічний тип топоізомерази |
| ДНК-лігаза | Повторно відпалює напівконсервативні пасма і приєднується Окадзакі. Фрагменти відстаючої пасма |
| Примаза | Забезпечує вихідну точку РНК (або ДНК) для ДНК-полімерази для початку синтезу нової ланцюга ДНК. |
| Теломераза | Подовжує теломерну ДНК шляхом додавання повторюваних нуклеотидних послідовностей до кінців еукаріотидних хромосом. |