8.3: Структура ДНК
- Page ID
- 6205
А. ранні підказки та постійні помилки
До 1878 року було показано, що речовина в гній поранених солдатів, отримане з ядер клітин (зване нуклеїном), складається з 5 основ (знайомих з ДНК та РНК). Чотири основи, які, як відомо, складають ДНК (як частину нуклеотидів), були з'єднані через фосфатні групи в короткі повторювані ланцюги з чотирьох нуклеотидів. До 1940-х років ми знали, що ДНК - це довгий полімер. Проте, він все ж вважався занадто простим для обліку генів (див. Вище). Після експериментів Hershey і Chase лише кілька холдутів не приймуть ДНК як генетичний матеріал. Отже, питання, що залишилося, полягало в тому, як така «проста» молекула може враховувати всі гени, навіть в такому простому організмі, як бактерія. Відповідь на це питання полягала в тому, щоб хоча б частково лежати в розумінні фізичної структури ДНК, що стало можливим завдяки появі рентгенівської кристалографії.
Якщо речовина може бути кристалізована, кристал буде дифрактувати рентгенівські промені під кутами, виявляючи регулярні (повторювані) структури кристала. Вільям Естбері продемонстрував, що високомолекулярна ДНК має саме таку регулярну структуру. Його кристалографи припускали, що ДНК є лінійним полімером складених основ (нуклеотидів), кожен нуклеотид відокремлений від наступного на 0,34 нм. Естбері також пам'ятають за те, що він придумав термін «молекулярна біологія» для опису своїх досліджень. Термін тепер охоплює як всі аспекти біомолекулярної структури, так і молекулярні функції (наприклад, реплікація, транскрипція, переклад, регуляція генів...).
За іронією історії російський біолог Микола Кольцов вже інтуїтував в 1927 році, що основою генетичної передачі ознак буде «гігантська спадкова молекула», що складається з «двох дзеркальних ниток, які будуть відтворюватися напівконсервативним способом, використовуючи кожну пасмо як шаблон». Досить фантастичний висновок, якщо подумати про це, оскільки він був запропонований задовго до того, як Уотсон і Крик та їхні колеги розробили структуру подвійної спіралі ДНК!
Вілкінс, Франклін, Уотсон і Крик
Моріс Вілкінс, англійський біохімік, першим виділив високочисту високомолекулярну ДНК. Працюючи в лабораторії Уілкінса, Розалінда Франклін змогла кристалізувати цю ДНК і виробляти рентгенівські дифракційні зображення кристалів ДНК дуже високої роздільної здатності. Найвідомішою (і остаточною) кристалографією Франкліна була «Фото 51», показана нижче.
Це зображення підтвердило розмір повторення Astbury 0.34 нм і виявило ще два числа, 3.4 нм і 2 нм, що відображають додаткові повторювані структури в кристалі ДНК. Коли Джеймс Уотсон і Френсіс Крик отримали ці цифри, вони використовували їх разом з іншими даними для побудови моделей ДНК з гайок, болтів і сантехніки. Їх моделі врешті-решт виявили, що ДНК є парою антипаралельних комплементарних полімерів нуклеїнових кислот..., відтінків макромолекул дзеркального зображення Кольцова! Кожна нитка являє собою низку нуклеотидів, пов'язаних фосфодіефірними зв'язками, дві нитки утримуються разом у подвійній спіралі шляхом взаємодоповнюючих взаємодій H-зв'язку.
Давайте подивимося на докази цих висновків і, як ми це робимо, зверніться до двох ілюстрацій подвійної спіралі нижче.
Згадуючи, що розмір 0,34 нм Естбері був відстанню між послідовними нуклеотидами в ланцюжку ДНК, Уотсон і Крик припустили, що повторення 3.4 нм було структурно значущим 10-кратним числу Естбері. Коли вони почали будувати свої моделі ДНК, вони зрозуміли з кутів зв'язку, що з'єднують нуклеотиди, що пасмо утворює спіраль, з чого зробили висновок, що повторення 3,4 нм - це крок спіралі, тобто відстань одного повного витка спіралі. Це означало, що на оборот спіралі було 10 баз. Вони також аргументували, що число 2,0 нм може відображати діаметр спіралі. Коли їх масштабна модель однониткової спіралі ДНК передбачила спіральний діаметр набагато менше 2,0 нм, вони змогли змоделювати подвійну спіраль, яка більш майже відповідала вимогам діаметра 2.0 нм. Будуючи свою подвійну спіраль, Уотсон і Крик зрозуміли, що основи в протилежних нитках зійдуться разом, утворюючи H-зв'язки, утримуючи спіраль разом. Однак, щоб їх подвійна спіраль мала постійний діаметр 2,0 нм, вони також зрозуміли, що менші піримідинові основи, тимін (T) та цитозин (C), повинні були б H-зв'язатися з більшим пурином основи, аденін (А) і гуанозин (G).
Тепер до питання про те, як «проста» молекула ДНК може мати структурне різноманіття, необхідне для кодування тисяч різних поліпептидів і білків. У ранніх дослідженнях очищена ДНК кишкової палички хімічно гідролізувалася до нуклеотидних мономерів. Продукти гідролізу містили майже однакову кількість кожної основи, посилюючи уявлення про те, що ДНК - це та проста молекула, яка не могла кодувати гени. Але Уотсон і Крик мали приватний доступ до розкриття даних від Ервіна Чаргаффа. Chargaff визначив базовий склад ДНК, виділеної з різних видів, включаючи кишкову паличку. Він виявив, що базовий склад ДНК різних видів не завжди був рівномолярним, а це означає, що для деяких видів ДНК не складалася з однакових кількостей кожної з чотирьох основ (див. Деякі з цих даних нижче).
Сам факт, що ДНК деяких видів може мати базові композиції, які відхилялися від рівноправності, поклав на спокій аргумент про те, що ДНК повинна бути дуже простою послідовністю. Нарешті, можна було з упевненістю прийняти це, щоб прийняти очевидне, а саме те, що ДНК дійсно є «речовиною генів».
Дані Chargaff також показали унікальну структуру базових коефіцієнтів. Хоча базові композиції можуть відрізнятися між видами, співвідношення A/T та G/C завжди було єдиним для кожного виду. Аналогічно співвідношення (A+C)/(G+T) і (A+G)/(С+Т). З цієї інформації Уотсон і Крик зробили висновок, що A (пурин) буде H-зв'язуватися з T (піримідином), а G (пурин) буде H-зв'язуватися з C (піримідином) у подвійній спіралі. При побудові своєї моделі з цією новою інформацією вони також виявили, що H-зв'язок між взаємодоповнюючими базами буде максимальним лише в тому випадку, якщо дві нитки ДНК були антипаралельними, що призводить до найбільш стабільної структури подвійної спіралі.
Уотсон і Крик опублікували свої висновки про структуру ДНК в 1953 році (Натисніть тут, щоб прочитати їх насіннєву статтю: Молекулярна структура нуклеїнових кислот: структура дезоксирибозної нуклеїнової кислоти. Їх стаття також славиться пророкуванням напівконсервативного механізму реплікації, те, що було передбачено Кольцовим 26 років тому, хоча і засноване на інтуїції... і набагато менше доказів!
Уотсон, Крік і Вілкінс розділили Нобелівську премію в 1962 році за свою роботу над структурою ДНК. На жаль, Франклін помер в 1958 році і Нобелівські премії не були присуджені посмертно. До цих пір існує суперечка про те, чому Франклін не отримала відповідної заслуги за свою роль у творі. Але вона отримує заслужене, давно відкладене визнання, включаючи університет в Чикаго, названий на її честь!
Підтвердження пропозиції Watson & Crick про напівконсервативну реплікацію прийшло з дуже елегантного експерименту Месельсона і Шталя, який перевірив три можливі моделі реплікації, показані нижче.
У своєму експерименті клітини кишкової палички вирощували в середовищі, що містить 15N, «важкий» ізотоп азоту. Через багато поколінь вся ДНК в клітині стала позначена важким ізотопом. У цей момент клітини з тегами 15N були поміщені назад у середовище, що містить більш поширений, «легкий» 14N ізотоп, і дозволили рости рівно одному поколінню.
Прогнози Месельсона і Шталя та їх експериментальна конструкція наведені нижче.
Месельсон і Шталь знали, що 14N-маркована і 15N-маркована ДНК утворюють окремі смуги після центрифугування на градієнтах щільності хлориду CScL. Вони перевірили свої прогнози шляхом очищення та центрифугування ДНК з 15N-мічених клітин, вирощених у середовищі 14N протягом одного покоління. Вони виявили, що ця ДНК утворює єдину смугу з щільністю між 15N-міченою ДНК та 14N-міченою ДНК. Цей результат усунув консервативну модель реплікації ДНК (як передбачали також Уотсон і Крик. Це залишило дві можливості: реплікація була або напівконсервативною, або дисперсійною. Дисперсійна модель була усунена, коли показано, що ДНК, виділена з клітин, вирощених для 2-го покоління на 14N, містить дві смуги ДНК на градієнтах щільності CScL.
Хромосоми
З початку 20 століття ми зрозуміли, що хромосоми містять гени. Тому виникає необхідність зрозуміти взаємозв'язок між хромосомами, хроматином, ДНК і генами. Як зазначалося раніше, хромосоми - це спеціалізований, конденсований варіант хроматину, з ключовими структурними особливостями, показаними нижче.
Тепер ми знаємо, що компактна структура хромосоми запобігає пошкодженню ДНК під час поділу клітин. Це пошкодження може виникнути, коли сили на центромери, породжені мітотичними або мейотичними волокнами веретена, витягують хроматиди. Коли ядро руйнується під час мітозу або мейозу, мікроскопісти кінця 19 століття побачили, що хромосоми конденсуються з дисперсного цитоплазматичного фону. Ці хромосоми залишалися видимими, коли вони відокремлювалися, рухаючись до протилежних полюсів клітини під час поділу клітин. Такі спостереження за поведінкою хромосом при діленні клітин вказували на їх роль у спадковості. Комп'ютерно розфарбована клітина при мітозі показана нижче.
Відрізнити одну хромосому від іншої можна за допомогою каріотипування. Коли клітини в метафазі мітозу поміщаються під тиском, вони лопаються і хромосоми розносяться. Таке поширення хромосом показано нижче.
До початку 1900-х років кількість, розміри та форми хромосом були показані специфічними для виду. Більше того, уважний погляд на поширення хромосом виявив, що хромосоми з'явилися в морфологічно узгоджених парах. Це настільки нагадувало парні спадкові фактори Грегора Менделя, що хромосоми тоді були широко прийняті як структурне місце генетичного успадкування. Розрізання мікрозображень, подібних до наведеного вище, і сполучення хромосом за їх морфологією породжує каріотип. Парні людські гомологи легко ідентифікуються на кольоровій мікрофотографії нижче.
Захоплені в мітозі, всі ділять клітини людини містять 23 пари гомологічних хромосом. Каріотип від самки; зверніть увагу на пару гомологічних статевих («Х») хромосом (праворуч внизу від врізки). X і Y хромосоми у чоловіків не є по-справжньому гомологічними. Хромосоми в початковому поширенні та у вирівняному каріотипі, забарвленому флуоресцентними антитілами до хромосомно-специфічних послідовностей ДНК, «освітлюють» різні хромосоми.