8.2: Матеріал генів
- Page ID
- 6202
Те, що всі еукаріотичні клітини містять ядро, було зрозуміло до кінця 19 століття. На той час гістологічні дослідження показали, що ядра містять значною мірою білки і ДНК. Приблизно в той же час набирало силу уявлення про те, що ядро містить генетичну інформацію. У 1910 році Альбрехт Коссель отримав Нобелівську премію 1910 року з фізіології та медицини за відкриття аденіну, тиміну, цитозину та гуаніну (чотири основи ДНК), а також урацилу в РНК. Закони спадкування Менделя, представлені в 1865 році, не були широко зрозумілі, ймовірно, тому, що вони спиралися на сильну дозу арифметики і статистики, коли корисність кількісної біології не дуже цінувалася. Але, після повторного відкриття через три десятиліття, кількість відомих успадкованих рис в будь-якому даному організмі швидко зросла. У той час ДНК була відома як невелика проста молекула, що складається лише з чотирьох нуклеотидів (див. Структура ДНК нижче для додаткової історичної перспективи). Отже, питання полягало в тому, як міг такий маленький, простий рахунок для успадкування такої кількості різних фізичних рис? Визнання того, що активність ферментів успадковувалася так само, як і морфологічні характеристики, призвело до гіпотези ферменту один ген-один, яка принесла Г. В. Бідл, Е. Л. Татум і Дж. Ледерберг Нобелівську премію з фізіології та медицини 1958 року. Коли пізніше ферменти були показані білками, гіпотеза стала одноген-один білок. Коли було показано, що білки складаються з одного або декількох поліпептидів, остаточною гіпотезою став одноген-однополіпептид. Однак цей зв'язок між генами та білками не пролила жодного світла на те, як ДНК може бути генетичним матеріалом. Насправді, зовсім навпаки! Оскільки ланцюги до 20 різних амінокислот, поліпептиди та білки мали потенціал для достатньої структурної різноманітності, щоб врахувати зростаючу кількість спадкових ознак в даному організмі. Таким чином, білки здавалися більш імовірними кандидатами на молекули успадкування.
Експерименти, про які ви прочитаєте тут, почалися приблизно на початку Першої світової війни і тривали до одразу після Другої світової війни. За цей час ми дізналися, що ДНК не є простим тетрамером, а насправді є довгим полімером. Це призвело до деяких дуже розумних експериментів, які зрештою змусили наукове співтовариство зробити висновок, що ДНК, а не білок, є генетичною молекулою, незважаючи на те, що вона складається лише з чотирьох мономерних одиниць. Нарешті, ми розглянемо класичну роботу Уотсона, Крика, Франкліна та Вілкінса, яка розкрила будову генетичної молекули.
Експеримент А.Гріффіта
Фред Нойфельд, німецький бактеріолог, який вивчав пневмококові бактерії на початку 1900-х років, виявив три імунологічно різні штами стрептококової пневмонії (типи I, II і III). Вірулентний штам (тип III) був відповідальним за більшу частину смертності під час пандемії іспанського грипу (грипу) 1918-1920 років. Ця пандемія вбила від 20 до 100 мільйонів людей, багато через те, що вірусна інфекція грипу послабила імунну систему інфікованих людей, зробивши їх сприйнятливими до бактеріальної інфекції стрептококової пневмонією.
У 1920-х роках Фредерік Гріффіт працював з вірулентними дикими типами (тип III) та доброякісними (тип II) штамами С. пневмонії. Два штами було легко відрізнити чашки Петрі, оскільки вірулентний штам ріс морфологічно гладкими колоніями, тоді як доброякісний штам утворював грубі колонії. З цієї причини два бактеріальних штами називалися S і R відповідно. Тепер ми знаємо, що S-клітини покриті капсулою з полісахариду (слизу), завдяки чому колонії здаються гладкими. На відміну від цього, R-клітинні колонії виглядають грубими (не блищать), оскільки їм не вистачає полісахаридного покриття.
Гріффіт знав, що ін'єкційні миші з S-клітинами вбили їх протягом приблизно дня! Ін'єкція нелетальних клітин R з іншого боку, не завдала шкоди. Потім він припустив, що, можливо, вплив мишей до штаму R S. пневмонії спочатку імунізує їх проти летальної інфекції S-клітинами. Його експериментальний протокол і результати, опубліковані в 1928 році, узагальнені нижче.
Щоб перевірити свою гіпотезу, Гріффіт вводив мишам R-клітини. Через деякий час він вводив їм S-клітини. Однак спроба імунізації мишей проти С. пневмонії не увінчалася успіхом! Контрольні миші, що вводять S-штамові клітини, і експериментальні миші, які спочатку отримували клітини штаму R, а потім S-клітини, всі померли в короткому порядку! Як і очікувалося, миші, введені R-клітинами, лише вижили.
Гріффіт також перевірив кров своїх мишей на наявність бактеріальних клітин:
· Миші, що вводяться доброякісними R (грубими) штамними клітинами, вижили, і після нанесення крові від мишей на живильне середовище не виросли клітини бактерій.
· Багато колоній S-клітин виросли з крові мертвих мишей, що вводяться S-клітинами.
Гріффіт виконав ще два експерименти, показані на ілюстрації:
1. Він вводив мишам убиті теплом S-клітини; як і очікувалося, ці миші вижили. Кров цих мишей не містила бактеріальних клітин. Це було «очікувано», оскільки нагрівання S-клітин повинно мати такий же ефект, як пастеризація на бактерії в молоці!
2. Гріффіт також вводив мишам суміш живих R клітин і убитих теплом S-клітин, сподіваючись, що комбінація може викликати імунітет у миші, де ін'єкції R-клітин поодинці не вдалося. Ви можете собі уявити його здивування, коли, далеко не будучи імунізованими, введені миші померли, а в їх крові накопичилися рясні S-клітини.
Гріффіт зрозумів, що в його експериментах сталося щось важливе. У суміші живих R клітин і убитих теплом S-клітин щось, що вивільняється з мертвих S-клітин, перетворило деякі R клітини. Гріффіт назвав це «чимось» трансформуючим принципом, молекулою, присутньою в уламках мертвих S-клітин і іноді набутою декількома живими R клітинами, перетворюючи їх на вірулентні S-клітини. Тепер ми знаємо, що R-клітинам не вистачає полісахаридної оболонки, і що імунна система клітини-господаря може атакувати і очищати R-клітини, перш ніж серйозна інфекція може заволодіти.
B. Експеримент Ейвері-Маклеода-Маккарті
Гріффіт не знав хімічної ідентичності трансформаційного принципу. Однак його експерименти призвели до досліджень, які довели, що ДНК є «речовиною генів». За допомогою вдосконалених методів молекулярного очищення, розроблених в 1930-х роках, О.Евері, Маклауд і М. МакКарті трансформували R клітини in vitro (тобто без допомоги миші!). Вони очистили убиті теплом S-клітинні компоненти (ДНК, білки, вуглеводи, ліпіди...) і окремо перевіряли трансформуючу здатність кожного молекулярного компонента на R клітині в пробірці.
Експерименти Ейвері та співавт. підсумовуються нижче.
Оскільки лише фракція ДНК мертвих S-клітин може спричинити трансформацію, Ейвері та співавт. прийшли до висновку, що ДНК повинна бути принципом трансформації. Незважаючи на ці результати, ДНК не була легко прийнята як матеріал генів. Точка прилипання полягала в тому, що ДНК складалася лише з чотирьох нуклеотидів. Незважаючи на те, що вчені знали, що ДНК - це великий полімер, вони все ще вважали ДНК такою простою молекулою, наприклад полімером, що складається з повторюваних послідовностей чотирьох нуклеотидів:
... АКТАГ CTAG CTAG CTAGCT...
Тільки, здавалося б, нескінченні комбінації 20 амінокислот в білках обіцяли біологічну специфіку, необхідну для обліку багатьох генетичних особливостей організму. Не маючи структурного різноманіття, ДНК пояснювалася як просто скаффолд для білкових генів. Щоб адаптувати відоме твердження маршала Маклухана про те, що середовище є повідомленням (тобто ефірні хвилі не просто передають, а є повідомленням), багато хто все ще вважав, що білки є середовищем генетичної інформації, а також власне функціональне повідомлення.
Небажання впливових вчених того дня прийняти принцип перетворення ДНК позбавило його першовідкривачів Нобелівської премії, яку вона заслужила. Після того, як нові докази зробили подальший опір цьому прийняттю неспроможним, навіть Нобелівський комітет визнав, що відмова від присудження Нобелівської премії за відкриття Ейвері та ін. була помилкою. Ключові експерименти Альфреда Херші та Марти Чейз нарешті поклали на спокій будь-яке уявлення про те, що білки були генами.
Експеримент «Герші-Чейз»
Біохімічно відомі бактеріальні віруси складаються з ДНК, укладеної в білкову капсулу. Життєвий цикл бактеріальних вірусів (бактеріофаг, або фаг коротко) починається з зараження бактерією, як показано нижче.
Фаги є інертними частинками, поки вони не зв'язуються з бактеріальними клітинами і не заражають Частинки фагів, додані до бактеріальної культури, можна побачити, як прикріплюються до бактеріальних поверхонь в електронному мікроскопі. Дослідники виявили, що вони можуть від'єднати частинки фагів від бактерій шляхом перемішування в блендері (подібно до того, який ви можете мати на вашій кухні). Потім центрифугування відокремлювало бактеріальні клітини в гранулі на дні пробірки центрифуги, залишаючи відокремлені частинки фагів у супернатанті. Додаючи фаг до бактерій, а потім від'єднуючи фаг від бактерій в різний час, можна було визначити, як довго фаг повинен був залишатися прикріпленим до зараження бактерій. Виявилося, що гранульовані клітини, які були прикріплені до фагу протягом короткого часу, виживуть і розмножуються при повторному підвішенні в середовищі росту. Але гранульовані клітини, що залишилися прикріпленими до фагу протягом тривалого часу, інфікувалися; відцентрово відокремлені від відокремленого фага і ресуспендуються в свіжому середовищі, ці клітини продовжуватимуться і лизуватися, виробляючи новий фаг. Тому перенесення генетичної інформації на вірулентність від вірусу до фага зайняв деякий час. Вірусний генетичний матеріал, відповідальний за інфекцію та вірулентність, мабуть, більше не був пов'язаний з фаговою капсулою, яку можна було відновити з відцентрового супернатанту.
Альфред Херші та Марта Чейз розробили експеримент, щоб визначити, чи викликала ДНК, укладена капсулою вірусного білка, або сам білок капсули, щоб фаг заразив бактерію. В експерименті вони окремо вирощували клітини кишкової палички, інфіковані бактеріофагом Т2 в присутності або 32 Р, або 35 S (радіоактивних ізотопів фосфору і сірки відповідно). В результаті було вироблено фаг, який містив або радіоактивну ДНК, або радіоактивні білки, але не обидва (нагадаємо, що тільки ДНК містить фосфор і тільки білки містять сірку). Потім вони окремо інфікували свіжі клітини кишкової палички або 32 P- або 35 S-мічених радіоактивним фагом. Їх експеримент описаний нижче.
Фаги та клітини інкубували або 32P, або 35S досить довго, щоб дозволити зараження. Деяким з кожної культури було дозволено йти далі і лизувати, щоб довести, що клітини були заражені. Залишок кожної суміші відправляємо в блендер. Після центрифугування кожної суміші гранули та супернатанти досліджували, щоб побачити, куди поділися радіоактивні білки або ДНК. З результатів, 32P завжди потрапляв у гранули бактеріальних клітин, тоді як 35S був знайдений у залишку фагів у супернатанті. Герші і Чейз дійшли висновку, що генетичним матеріалом бактеріальних вірусів є ДНК, а не білок, так само, як Ейвері та співавт. припустили, що ДНК є принципом перетворення бактерій.
Враховуючи раніше стійкість до того, що «проста» ДНК є генетичним матеріалом, Герші та Чейз використовували обережні мови при формуванні своїх висновків. Їх не потрібно мати; всі наступні експерименти підтвердили, що ДНК є генетичним матеріалом. Одночасно з цими підтвердженнями були експерименти, що демонструють, що ДНК не може бути (справді, не було) такою простою, нескладною молекулою! За свій остаточний внесок у закріплення ДНК як «речі генів» Альфред Герші поділився Нобелівською премією з фізіології та медицини 1969 року з Максом Дельбрюком та Сальвадором Лурією.