7.3: Реплікація прокаріотів

Реплікація ДНК починається з походження реплікації. Існує лише одне походження у прокаріотів (у кишкової палички, OriC) і воно характеризується масивами повторюваних послідовностей. Ці послідовності обертаються навколо ДНК-зв'язуючого білка, і при цьому чинять тиск на Н-зв'язки між нитками ДНК, і хромосома починає розпаковуватися в багатій на АТ області, загорнутій навколо цього білка. Пам'ятайте, що пари А-Т на 33% слабкіші, ніж пари G-C через меншу кількість водневих зв'язків. Використання багатих на Ат розтяжок ДНК як точок поділу ниток є повторюваною темою через різні операції ДНК. Поділ двох ниток є двонаправленим, і ДНК-полімерази будуть діяти в обох напрямках, щоб якомога швидше закінчити процес. Швидкість тут важлива, оскільки, поки відбувається реплікація, ДНК вразлива до поломки, і більшість обмінних процесів припиняються, щоб присвятити енергію реплікації. Навіть у прокаріотів, де молекули ДНК на порядки менше, ніж у еукаріотів, розмір молекули ДНК при її розплутанні з білків захисної упаковки робить її дуже сприйнятливою до фізичних пошкоджень саме від рухів клітини.

Перший OriC зв'язуючий білок, DNaA, зв'язується з коробками DNaA, які представляють собою 9 сегментів базової пари з консенсусною послідовністю TTATCCACA. OriC має п'ять таких повторів, і один білок ДНК зв'язується з кожним з них. HU та IHF - це гістоноподібні білки, які асоціюються з ДНКА і разом згинають цю частину ДНК в круговий цикл, розміщуючи її трохи над іншою основною особливістю OriC, 13-bp AT-багатими повтореннями (GATCTNTTNTTTTT). ДНКА гідролізує АТФ і розриває Н-зв'язки між нитками в 13-мерних повтореннях, також відомих як плавлення ДНК. Це дозволяє комплекси dNaB [і dNaC, який є завантажувальним білком, який допомагає прикріпити DnAb (6) до пасма з супутнім гідролізом АТФ. Крім того, набирають ще п'ять ДНК для стабілізації петлі.] для зв'язування з кожною одноцепочечной областю ДНК з протилежних сторін знову відкритого бульбашки реплікації.

DnAb - це геліказа; його ферментативна активність полягає в розпакуванні/розкручуванні ДНК попереду ДНК-полімерази, щоб дати їй одноцепочечной ДНК для читання та копіювання. Це робиться в асоціації з однонитковими ДНК зв'язуючими білками (SSB) та ДНК-гіразою. Функція SSB майже не зрозуміла: одноланцюгова ДНК схожа на РНК у своїй здатності утворювати складні вторинні структури шляхом внутрішнього сполучення основи, тому SSB запобігає цьому. ДНК-гіраза є топоізомеразою II типу, і перед нею покладено завдання введення негативного суперколінгу в ДНК. Це необхідно тому, що розпакування ДНК по спіралі також розкручує її (так як вона є подвійною спіраллю) і викликає введення позитивного суперколінга. Це означає, що вся кругова молекула закручується на собі: уявіть, що тримаєте в двох руках гумку і скручуєте її. У міру накопичення суперкотушки ДНК стає більш щільно згорнутою, аж до того, що її неможливо було б розпакувати helicase. DNAB/гіраза може зняти цей стрес, тимчасово розрізавши дволанцюгову ДНК, пропустивши петлю молекули через щілину та перегерметизувавши її.

Малюнок\(\PageIndex{8}\). ДНК-топоізомерази II типу, такі як ДНК-гіраза, полегшують супернамотування, роблячи тимчасовий двонитковий розріз.

Це (сподіваємось) має набагато більше сенсу, дивлячись на діаграму. Або, повертаючись назад до нашої гумці, даємо гумці скрутку або два, потім скотчем два кінці. Якщо обрізати гумку, і протягнути сусідню частину гумки через цей ножик, потім знову з'єднати зрізані кінці, ви виявите, що є на одну скрутку менше. Ніфті, а? У цей момент деякі з вас скажуть, але якщо ви крутите вільно плаваючу гумку, як можна уявити вільно плаваючу кругову хромосому ДНК в E. coli, ви очікуєте, що вона природним чином розкрутиться. Технічно так, але через велику масу хромосоми, її зв'язку з різними білками і клітинною мембраною, а також в'язкості навколишнього середовища вона не веде себе так, як ніби повністю вільна.

Малюнок\(\PageIndex{9}\). Деталь дії ДНК-топоізомерази II типу. (A) По-перше, фермент зв'язується з ДНК і ініціює активність ендонуклеази, вирізаючи обидві нитки ДНК в цей момент. (B) Ця повна перетин ДНК (на відміну від однониткових розрізаних топоізомеразами типу I) дозволяє іншій частині тієї ж молекули ДНК прослизати через щілину. (C) Нарешті, два тимчасово зламані кінці ДНК, які були тісно утримувані на місці ферментом.

Після того, як OriC був відкритий і спіралі прикріплені до двох сторін вилки реплікації, машина реплікації, ака реплікація може почати формуватися. Однак перш ніж ДНК-полімерази займуть позиції, їх потрібно заґрунтувати. ДНК-полімерази не в змозі з'єднати два окремих вільних нуклеотиди разом, щоб почати утворювати нуклеїнову кислоту; вони можуть додавати лише на раніше існуючу нитку щонайменше двох нуклеотидів. Тому спеціалізована РНК-полімераза (RNAP не мають цього обмеження), відома як примаза, є частиною реплісоми, і читає створює коротку нитку РНК під назвою праймер для ДНК-полімерази для додавання на. Хоча потрібні лише кілька нуклеотидів, прокаріотичні праймери можуть становити 60 нт залежно від виду.

На сьогоднішній день виявлено щонайменше п'ять прокаріотичних ДНК-полімераз. Первинною ДНК-полімеразою для реплікації у кишкової палички є ДНК-полімераза III (Пол III). Пол I також бере участь у базовому механізмі реплікації ДНК, перш за все в прогаливах, створених під час відстаючого синтезу ланцюга (визначено 3 сторінки вперед) або за допомогою механізмів виправлення помилок. ДНК-полімераза II і нещодавно виявлені Пол IV і Пол V не беруть участі в хромосомній реплікації, а скоріше використовуються для синтезу ДНК, коли певні типи репарації необхідні в інший час клітинного життєвого циклу.

ДНК-полімераза III - багатосубодиничний голофермент, з α, ε та θ субодиницями, що містять основну полімеразу, і τ, γ, δ, δ ', θ, ψ та β збираються разом, утворюючи повний голофермент. Основна полімераза має дві види діяльності: α субодиниця - це функція полімерази, зчитуючи нитку ДНК та синтезуючи комплементарну нитку з великою швидкістю, близько 150 нт/сек; ε субодиниця є екзонуклеазою 3'-5' і діє як безпосередній коректор, видаляючи останній нуклеотид, якщо він неправильний. Це доказ - читання не повертається далі: воно діє лише на останній доданий нуклеотид для виправлення дезінкорпорації. Інші механізми та ферменти використовуються для корекції уражень ДНК, що виникають в інший час. [Що стосується номенклатури, екзонуклеази відрізають нуклеотиди з ДНК або РНК лише з обох кінців, але не посередині. Ендонуклеази розщеплюють фосфодіефірні зв'язки, розташовані глибше всередині нитка нуклеїнової кислоти.] θ субодиниця не має ферментативної активності і регулює екзонуклеазну функцію. Хоча він має полімеразну активність, полімераза ядра Pol III має погану технологічність - тобто вона може додавати лише до 15 нуклеотидів перед дисоціацією від шаблонної ДНК. Оскільки геноми штамів кишкової палички в середньому близько 5 мільйонів пар основи, реплікація у невеликих сегментах 15 nt була б надзвичайно неефективною.

Малюнок\(\PageIndex{10}\). Димерний β затиск утримує ДНК-полімеразу III на шаблоні, дозволяючи йому полімеризувати більше нуклеотидів перед дисоціацією.

Комплекс затискачів навантажувача - це вузол АТФази, який зв'язується з блоком β-затиску при зв'язуванні АТФ (але активність АТФази не вмикається). Коли комплекс потім зв'язується з ДНК, він активує АТФазу, і отриманий гідроліз АТФ призводить до конформаційних змін, які тимчасово відкривають затиск (для оточення або відходу від ланцюга ДНК), а потім дисоціації навантажувача затиску від вузла затиску.

Саме тут і потрібна β субодиниця. Також відомий як β затиск, він являє собою димер напівкруглих субодиниць, який має центральний отвір, через який проходить ДНК. Основний полімераза за допомогою α-β взаємодії приєднується до цього β затиску так, що він довше залишається на ДНК, збільшуючи технологічність Pol III до понад 5000nt. β затискач завантажується на (і вивантажується з) ДНК комплексом затискача навантажувача (також називається γ комплексом), що складається з γ (x3), δ, Δ', θ та ψ субодиниць.

Бульбашка реплікації має дві вилки реплікації - після того, як ДНК відкривається (розпаковується) на початку, на кожному кінці може утворитися машина реплікації, при цьому спіралі рухаються в протилежних напрямках. Для спрощення ми розглянемо лише одну вилку — відкриття зліва направо — в цій дискусії з розумінням того, що те ж саме відбувається з іншою вилкою, але в зворотному напрямку.

Перше, що слід помітити, дивлячись на діаграму вилки реплікації (рис.\(\PageIndex{11}\)), - це те, що дві однониткові частини шаблонної ДНК є антипаралельними. Це не повинно стати несподіванкою на даний момент в курсі, але це вводить цікаву механічну проблему. Helicase відкриває подвійну багатониткову ДНК і веде решту машини реплікації вздовж. Отже, в одножильний області, що закінчує спіраль, якщо ми подивимося зліва направо, одна нитка шаблону становить від 3 'до 5' (синім кольором), а інша - від 5' до 3' (червоним). Оскільки ми знаємо, що нуклеїнові кислоти полімеризуються шляхом додавання 5' фосфату нового нуклеотиду до 3' гідроксилу попереднього нуклеотиду (5 'до 3', зеленим кольором), це означає, що одна з ниток, яка називається провідною ниткою, синтезується в тому ж напрямку, що і машина реплікації рухається. Там немає проблем.

Інша нитка проблематична: якщо дивитися на лінійно, щойно синтезована нитка буде йти від 3 до 5' зліва направо, але ДНК-полімерази не можуть додавати нуклеотиди таким чином. Як клітини вирішують цю проблему? Запропоновано ряд можливостей, але нинішня модель зображена тут. Машина реплікації складається з хелікази, примази та двох голоферментів ДНК-полімерази III, що рухаються в одному фізичному напрямку (слідуючи за хеліказою). Насправді комплекси pol III фізично пов'язані через τ субодиниць.

Малюнок\(\PageIndex{11}\). Реплікація ДНК у прокаріотів.

Для того, щоб шаблонна пасмо, яка становить від 5 'до 3' зліва направо, була реплікована, пасмо потрібно подавати в полімеразу назад. Це може бути досягнуто або шляхом повороту полімерази навколо або шляхом зациклювання ДНК навколо. Як показано на малюнку, поточна модель полягає в тому, що примаза також рухається вздовж зліва направо, тому у неї є лише короткий час, щоб швидко синтезувати короткий праймер, перш ніж рухатися вперед з реплісомою і знову запускати, залишаючи переривчасті праймери на його хвилі. Через це Пол III змушений синтезувати за один раз лише короткі фрагменти хромосоми, звані фрагментами Окадзакі після їх першовідкривача. Пол III починає синтезувати шляхом додавання нуклеотидів на 3' кінець праймера і триває до тих пір, поки він не потрапить в 5' кінець наступного праймера. Він не (і не може) з'єднувати пасмо, яку синтезує з кінцем праймера 5'.

Реплікація ДНК називається напіврозривним процесом, оскільки, поки провідна нитка синтезується безперервно, відстаюча нитка синтезується фрагментами. Це призводить до двох основних проблем: по-перше, у новоспечених нитках залишаються маленькі шматочки РНК (якраз на 5' кінці для провідної нитки, у багатьох місцях для відставання); і по-друге, Пол III може додавати вільні нуклеотиди лише до фрагмента однониткової ДНК; він не може з'єднати інший фрагмент. Тому нова «пасмо» не ціла, а пронизана відсутніми фосфодіефірними зв'язками.

Перша проблема вирішується ДНК-полімеразою I. На відміну від Пол III, Пол I є мономерним білком і діє окремо, без додаткових білків. Також молекул Пол I в 10-20 разів більше, ніж молекул Пол III, так як вони потрібні для такої кількості фрагментів Окадзакі. ДНК-полімераза I має три види діяльності: (1) як Пол III, він може синтезувати ланцюг ДНК на основі шаблону ДНК, (2) також як Пол III, це екзонуклеаза для коректури 3'-5', але на відміну від Pol III, (3) це також 5'-3' екзонуклеаза. Активність екзонуклеази 5'-3' має вирішальне значення при видаленні праймера РНК (рис.\(\PageIndex{12}\)). Екзонуклеаза 5'-3' зв'язується з дволанцюговою ДНК, яка має однонитковий розрив у хребті фосфодіефіру, наприклад, що відбувається після того, як фрагменти Окадзакі були синтезовані з одного праймера до іншого, але не можуть бути з'єднані. Ця 5'-3' екзонуклеаза потім видаляє праймер РНК. Полімеразна активність потім додає нові нуклеотиди ДНК до фрагмента Окадзакі вище за течією, заповнюючи щілину, створену видаленням праймера РНК. Коректура екзонуклеази діє так само, як і для Pol III, негайно видаляючи нещодавно включений неправильний нуклеотид. Після коректури загальна частота помилок включення нуклеотидів становить приблизно 1 з 107.

Технічно екзонуклеаза 5'-3' розщеплює ДНК в дволанцюжковій області нижче за течією від ніка, а потім може видалити де-небудь з 1-10nt одночасно. Експериментально активність екзонуклеази 5'-3' може бути відщеплена від решти Pol I трипсином протеази. Це створює «фрагмент Кленоу», що містить полімеразу та екзонуклеазу коректури 3'-5'.

Малюнок\(\PageIndex{12}\). Відстаючий синтез пасма. Після того, як ДНК-полімераза III розширила праймери (жовті), ДНК-полімераза I видаляє праймер і замінює його додаванням на попередній фрагмент. Коли він закінчує видалення РНК і замінюючи її ДНК, він залишає ДНК з відсутнім фосфодіефірним зв'язком між pol III-синтезованою ДНК вниз за течією і pol I-синтезованою ДНК вище за течією. Цей розрив цукрово-фосфатного хребта відновлюється ДНК-лігазою.

Незважаючи на те, що РНК була замінена ДНК, це все одно залишає фрагментовану нитку. Нарешті з'являється останній великий гравець в історії реплікації ДНК: ДНК-лігаза. Цей фермент має одну просту, але вирішальну задачу: він каталізує атаку 3'-ОН з одного фрагмента на 5' фосфат наступного фрагмента, генеруючи фосфодіефірний зв'язок. Ця реакція вимагає енергії у вигляді гідролізу АТФ або NAD ⁺ залежно від виду (E. coli використовує NAD ⁺), що генерує AMP і або PP _i або NMN ⁺.