3.4: Регуляція активності ферментів

Рисунок\(\PageIndex{7}\) (і 9) також ілюструє вплив двох різних типів інгібування на різні компоненти ферментної кінетики. Ферменти можуть бути сповільнені або навіть запобігти каталізації реакцій різними способами, включаючи запобігання потраплянню субстрату в активну ділянку або запобігання ферменту від зміни конформації для каталізації реакції. Інгібітори, які роблять це, можуть зробити це або оборотно, або необоротно. Незворотні інгібітори також називаються інактиваторами, і або зв'язуються з ферментом з такою високою афінітністю, щоб бути практично незворотними, або вони фактично утворюють ковалентні зв'язки з ферментом. Оборотні інгібітори, як правило, групуються в два основних типи: конкурентні та неконкурентні.

Фінастерид (торгові назви включають Propecia і Proscar) є незворотним інгібітором, який дуже щільно зв'язується з ферментом 5-а-ре- дуктази, використовується в перетворенні тестостерону в дигідротестостерон. Він використовується в лікуванні чоловічого облисіння, доброякісної про- статичної гіперплазії та раку передміхурової залози.

Аспірин є прикладом незворотного інгібітора, який фактично утворює ковалентний зв'язок з ферментом. Аспірин (ацетилсаліцилова кислота) переносить свою ацетильну групу на залишок серину на циклооксигеназі-2 (ЦОГ-2). Це зупиняє вироблення в аммації продукують простагландинів і тромбоксанів ЦОГ-2.

Метотрексат є конкурентним інгібітором дигідрофолатредуктази (DHFR), ферменту, який синтезує тетрагідрофолат, який є попередником синтезу пурину, а отже, для ДНК і РНК. Він має дуже схожу молекулярну структуру для фолієвої кислоти, природного субстрату DHFR. Метотрексат використовується як протираковий препарат, оскільки він впливає на швидко розмножуються клітини (які повинні зробити ДНК раніше, ніж інші клітини) більше, ніж на неракові клітини.

Конкурентне гальмування, мабуть, найпростіше для розуміння. Молекула інгібітора конкурує безпосередньо з субстратом за активну ділянку незв'язаного ферменту. Якщо інгібітор зв'язується з активним місцем, субстрат не може цього зробити, поки інгібітор не звільнить ділянку. Таким чином, можна потенційно перевантажити конкурентне інгібування досить більшими концентраціями субстрату, так що ймовірність того, що фермент потрапляє в субстрат для зв'язування, стає перевищенням великої порівняно з ймовірністю натикання на інгібітор. Нормальний, розгальмований V _max потім досягається, незважаючи на наявність конкурентного інгібітора, який вплинув лише на K _m, тобто концентрацію субстрату, необхідну для досягнення V _max /2. Це кінетична ознака конкурентних інгібіторів: зі збільшенням концентрації інгібіторів K _M збільшується, але V _max не впливає.

Малюнок\(\PageIndex{9}\). Криві насичення для ферментно-каталізованих реакцій без інгібітора (червоний) з конкурентним інгібітором (синій) при постійній концентрації та з неконкурентним інгібі-тором (зеленим) при постійній концентрації.

Неконкурентне інгібування передбачає інгібування ферменту шляхом зміни його здатності завершувати каталізовану реакцію шляхом зв'язування ферменту в положенні, яке не є активним місцем. Коли інгібітор зв'язується з ферментом, він спричиняє зміни, зазвичай con- формаційні, які можуть або перешкодити ферменту зв'язувати субстрат, або запобігти дії ферменту на зв'язаний субстрат. У будь-якому випадку збільшення доступності субстрату не дозволить в кінцевому підсумку подолати дію інгібітора. Таким чином,\(V_{max}\) зменшується не тому, що деяка частка ферментів більше не придатна для використання, а тому, що наявні ферменти мають такий же доступ до субстрату, як це було б без інгібітора (тобто він не конкурує з інгібітором), на\(K_m\) це не впливає.

Аллостерія

Неконкурентне регулювання є одним із прикладів аллостеричної регуляції ферментів. Аллостеричні взаємодії відбуваються, коли зв'язування ліганда (не обов'язково субстрату) з білком впливає на зв'язування іншого ліганду з білком в окремому місці зв'язування. Ці види взаємодій можуть бути як позитивними (активують), так і негативними (інгібуючі), і або гомотропними (обидва ліганди ідентичні) або гетеротропними (ліганди різні). Цікаво, що іноді ліганд регулятора може насправді бути продуктом каталізованої реакції. У такому вигляді механізму зворотного зв'язку прогрес реакції саморегулюється.

Малюнок\(\PageIndex{10}\). Шлейфи управління зворотним зв'язком. (Зліва) Негативний зворотний зв'язок є загальним біологічним механізмом саморегулюючих процесів. Продукт реакції як сам по собі, так і взв'язці з іншими молекулами виступає в ролі алостеричного інгібітора ферменту. (Праворуч) Позитивний зворотний зв'язок зустрічається рідше, оскільки може призвести до швидкого розширення сфери реакції, і вимагає зовнішнього (щодо ферментативної реакції) механізму для уповільнення або зупинки реакції.

Багато ферментів в метаболічних шляхах (глави 5 і 6) регулюються природним неконкурентним інгібітором. Одним із прикладів є фосфофруктокіназа (ПФК), яка бере участь в гліколізі, який виробляє АТФ для клітини. Однак, якщо в клітині є досить високий рівень АТФ, який інші клітинні процеси не використовують, то він може зв'язуватися з фосфофруктокіназою поза її активною ділянкою (вона зв'язує фруктозо-6-фосфат) і вимкнути її. Це блокує гліколіз і вироблення надлишку АТФ, коли клітина не потребує цього. Оскільки АТФ використовується, є менш доступним для інгібування ПФК, і гліколіз починається резервне копіювання.

Моделювання аллостеричної поведінки

Існує дві моделі таких аллостеричних взаємодій.

• Модель симетрії, також відома як узгоджена модель, або модель MWC (Monod, Wyman та Changeux, 1965), передбачає, що аллостеричний фермент є олігомером з декількох субодиниць, кожна з яких симетрично пов'язана, і може перебувати або в «напруженому», або «розслабленому» стані, але всі субодиниці знаходяться в в тому ж стані і при рівновазі. Коли ліганд зв'язується, він змінює стан субодиниці (ів), з якою він зв'язується, і підтримувати рівновагу, що, в свою чергу, призводить до збігу стану інших субодиниць, змінюючи тим самим властивості зв'язування для подальшого ліганду.
• Послідовна модель, або модель KNF (Koshland, Nemethy та Filmer, 1966), пропонує щось зовсім інше: хоча вона також передбачає субодиниці в напружених або розслаблених станах, вона не вимагає, щоб усі субодиниці були з'єднані таким чином, щоб наказати, щоб усі субодиниці були в одному стані , і тому конформаційні зміни в одній субодиниці не потрібно поширювати на всіх. Натомість, використовуючи індукційну модель зв'язування лігандів, а не більш жорсткий основний механізм блокування та ключа, це говорить про те, що коли ліганд зв'язується з ферментом, він індукує незначну конформаційну зміну активної ділянки, що збільшує його спорідненість до ліганду. Конформаційна зміна може трохи змінити конформацію інших субодиниць ферменту, але не може становити зміну стану між розслабленим та напруженим залежно від того, наскільки щільно взаємодіють субодиниці. Однак зміни достатньо, щоб збільшити спорідненість субстрату в сусідніх субодиницях.

Розширений: неконкурентне та змішане гальмування

Більшість клітинних/молекулярних курсів зупиняють обговорення інгібіторів ферментів у конкурентних та неконкурентних на основі їх кінетичних профілів. Однак слід зазначити, що якщо ви проходите курс біохімії, ви можете зіткнутися з термінами неконкурентний інгібітор і змішаний інгібітор. Ці терміни визначаються не просто кінетикою ферменту, а механізмом взаємодії:

• Неконкурентні інгібітори зв'язуються тільки з комплексом фермент-субстрат (ЕС), а не з ферментом до того, як він зіткнувся з субстратом. Це призводить до зниження V _max і зниження K _m.
• Змішане інгібування означає, що інгібітор може зв'язуватися або з ферментом самостійно, або з комплексом фермент-субстрат. Оскільки спорідненість інгібітора для двох форм ферменту різна, і оскільки частина його залежить від концентрації субстрату, тоді як інший вид зв'язування не відбувається, як правило, V _max зменшується, а K _m збільшується. Неконкурентне інгібування - це особливий випадок змішаного інгібування, при якому каталітична активність ферменту зменшується або скасовується, але здатність зв'язувати субстрат незмінна.

Інші механізми гальмування

Хоча важливо, особливо фармацевтично, використання інгібіторів ферментів не є єдиним способом регулювання ферментів. Є численні приклади одного типу ферменту, що активує або інгібує інший. Найпоширенішим загальним прикладом є протеїнкінази. Ці ферменти фосфорилюють (переносять фосфатну групу в) інші ферменти і тим самим активізують їх. Кінази, як правило, швидкі і дуже специфічні, і це ефективний метод для швидкої активації великої кількості певних ферментів. І навпаки, білкові фосфатази - це ферменти (також досить швидкі, але набагато менш специфічні, ніж кінази), які видаляють фосфатні групи з фосфорильованих білків, тим самим відключаючи ці ферменти. Майте на увазі, що це узагальнення, і що не всі фосфорилювання активізуються. Крім ферментативного інгібування ферментів, відбувається також інгібування шляхом зв'язування і секвестрації субстратів. Насправді антибіотик ванкоміцин діє саме так, зв'язуючись з субстратним пептидом для транспептидази і не даючи ферменту його розпізнавати. Транспептидаза зазвичай допомагає стабілізувати клітинну стінку певних бактерій, змінюючи деякі білки, і без її активності захист клітинної стінки порушується, і бактерії можуть бути легше вбиті.

Значно більше половини виявлених до цих пір ферментів не діють у спрощеному механізмі «один субстрат-один продукт» Міхаеліса-Ментена, а працюють з двома субстратами та двома продуктами, як правило, з перенесенням активної групи. Ці типи реакцій іноді відомі як реакції Бі Бі. Існує два основних класи цих реакцій: послідовні реакції, при яких всі субстрати зв'язуються з ферментом до того, як протікає реакція, і реакції пінг-понгу, при яких один або кілька продуктів створюються і звільняються до того, як всі субстрати були пов'язаний. Насправді, на відміну від послідовних реакцій, два субстрати не взаємодіють один з одним, зв'язуючись з ферментом.

Оптимальні умови

На активність ферментів сильно впливають як рН, так і температура, як очікується від обговорення структури білка в попередньому розділі. Профілі активності більшості ферментів показують пік активності, який зникає з обох сторін, будь то рН або температура. Це вроджена характеристика ферменту. Наприклад, пепсин, травний фермент, що виділяється в шлунок (рН 2), не функціонує при pH > 5. З іншого боку, інший травний фермент, трипсин, який секретується в дванадцятипалу кишку (проксимальний тонкий кишечник), де рН становить ~ 8, не працює в кислих середовищах. Зміни рН можуть змінити іонізацію бічних ланцюгів амінокислот, які можуть тим самим змінити взаємодію з субстратом або призвести до змін третинної структури.

Рис\(\PageIndex{11}\). рН залежність ферментативної активності. На цьому графіку зображені три гіпотетичні ферменти з кислотним, нейтральним і основним pH optima.

Аналогічно, при неоптимальних температурах ймовірність взаємодії білка-субстрат низька, але вище оптимальної температури, підвищена енергія може призвести до розриву водневих зв'язків всередині структури ферменту, в результаті чого відбуваються зміни, які в- активують каталітичну здатність ферменту або перешкоджають його зв'язуючий субстрат з достатньою спорідненістю. Температурний оптимум більшості ферментів дуже близький до його типового середовища. Таким чином, людський фермент буде оптимально працювати близько 37° C, тоді як фермент бактерій, які живуть у глибоководних вулканічних отворах (наприклад, Thermophilus aquaticus), може мати оптимальну температуру понад 90° C Це одна з причин того, що охолодження може уповільнити ріст мікроорганізмів (що очевидно не мають можливості регулювати свою температуру), і чому більшість мікроорганізмів гинуть (ферменти постійно денатуруються) при введенні в стійкі високотемпературні середовища. Цікаво, що ДНК-полімераза з бактерій T. aquaticus, яку також називають полімеразою Taq, використовується в швидкій лабораторній техніці, що підсилює ДНК, відомій як ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція, див. Розділ Методи), в якій зразки багаторазово нагріваються до високих температур, щоб відокремити нитки ДНК в підготовка до виготовлення їх копій. ДНК-полімерази більшості прокаріотичних або еукаріотичних видів будуть денатуровані та активовані високим теплом, але Taq еволюціонував (стосовно його третинної структури) для надзвичайної структурної стабільності навіть у екстремальних термічних умовах.

Нарешті, багато ферментів вимагають молекулярного партнера, який не має власної каталітичної активності, але, як каталізатор, не постійно змінюється хімічною реакцією. Ці молекули є кофакторами. Деякі прості: насправді елементарні, включаючи іони металів, такі як Zn ²⁺ або Ca ²⁺. Інші трохи складніше: дрібні органічні кофактори називаються коферментами, і виконують те ж саме, виступаючи необхідним партнером ферменту в каталізації реакції. Взаємодія з самим ферментом змінюється і може бути лише транзиторною, як у NAD ^+/NADH, які є коферментами, що використовуються в окисно-відновних реакціях, або постійно пов'язані з ферментом ковалентним зв'язком, як гемова група гемоглобіну. Часто функція коферменту полягає в забезпеченні активної групи для полегшення каталізованої реакції. Коензим А в різних метаболічних шляхах, таких як гліколіз або цикл трикарбонової кислоти, може бути пов'язаний з субстратом, утворюючи стабільний продукт, який потім діє як проміжний продукт. Co-A вивільняється з молекули, коли вона проходить наступний етап у серії реакцій в метаболічному шляху (див. Розділ 5).

З точки зору здоров'я людини цікаво відзначити, що багато коферментів є вітамінами, або отриманими з вітамінів. Це вітаміни групи В, біотин (B ₇), кобаламін (B ₁₂), фолієва кислота (B ₃), ніацин/нікотинамід (B ₉), пантотенова кислота (B ₅), піридоксин (B ₆), рибофлавін (B ₂) і тіамін (B ₁). Вітаміни - це невеликі органічні сполуки, які не синтезуються організмом і тому повинні потрапляти в організм. Вони взагалі потрібні лише в невеликих кількостях, але все ж необхідні. Природно, що знайомі нам вітаміни - це ті, які потрібні людині. Конкретні ролі цих вітамінів та послідовності їх недостатньої кількості обговорюються пізніше в цьому підручнику, оскільки ферменти, з якими вони працюють, детально вводяться.