Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

16.6: Мікро-звіт 5- SDS-PAGE та аналіз західного блота

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    4173

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    У цьому звіті ви опишіть результати SDS-PAGE та західних блотів, які ви використовували для аналізу експресії білка в перетворених клітині як в репресованих, так і в індукованих умовах. Зверніть особливу увагу на те, наскільки ці результати підтверджують або суперечать результатам попереднього звіту про трансформацію/доповнення. Малюнок повинен бути маркований таким чином, щоб досвідчений вчений зміг зрозуміти ваші результати тільки з малюнка і легенди. Багато експериментальних деталей були переведені до розділу M & M. Смуги повинні бути чітко позначені, а молекулярні ваги стандартів повинні бути включені. (Нижче наведено приклад з іншого класу, де студенти використовували SDS-PAGE та західні блоти для аналізу надмірної експресії дріжджових білків, виражених з PbG1805. Зверніть увагу, що, на відміну від ваших експериментів, первинне антитіло до епітопу ГК використовувалося для виявлення білків на західних плямах.)

    Матеріали і методи: Надайте інформацію про трансформовані штами, умови інкубації, отримання клітинних екстрактів, гелі SDS-PAGE та західні блоти. Посилання опубліковані процедури, коли це можливо, відзначаючи будь-які зміни. Підзаголовки можуть бути корисними.

    Трансформовані штами: Включіть назви штамів і плазмід, які ви використовували для приготування клітинних екстрактів.

    Екстракти: Включити інформацію про засоби масової інформації та час інкубації, що використовуються для маніпулювання надмірною експресією білка від штамів. Зверніться до керівництва по процедурі вилучення, зазначивши будь-які модифікації.

    SDS-PAGE гелі: Надайте детальну інформацію про% акриламіду гелів, час роботи та напругу, що використовується для електрофорезу.

    Електрофоретичний перенесення: Увімкніть час та напругу, що використовуються для перенесення білків з гелю SDS-PAGE до мембрани PVDF. Для отримання інших подробиць зверніться до посібника.

    Вестерн-блот: Включіть антитіла, які ви використовували для плям, та умови (час, температура), які ви використовували для кожної з інкубацій. Увімкніть час, який ви використовували для виявлення надмірної експресії білків за допомогою ТМБ. (Це дає деяке відчуття великої кількості білка у ваших екстрактах.) Вам НЕ потрібно включати всі етапи прання - просто зверніться до керівництва.

    Результати та обговорення - Почніть з обговорення гелю SDS-PAGE. Гель SDS-PAGE забезпечує знімок клітинних білків і грубе порівняння концентрацій білка в різних екстрактах. Інтенсивність фарбування смуги відображає її велику кількість в екстракті.

    • Як загальна кількість білка порівнювалася між індукованими та неіндукованими зразками? (Що це може свідчити про різні джерела вуглецю?)
    • Ви бачили якісь зміни в окремих смугах на гелі? Чи можна виявити злитий білок на тлі інших білків в екстракті? Нагадаємо, що клітини мають тисячі білків і що група може складатися з більш ніж одного виду білка.

      Вестерн блот дозволяє виявити злитий білок на тлі інших клітинних білків. Включіть таблицю із прогнозованими та фактичними розмірами протеїнів Met або LaCZ, виявлених за допомогою техніки західного блота. Розміри білків особливо важливі. (Напевно, неможливо отримати точне значення розмірів білка, через нечіткість стандартів на західних плямах. Тим не менш, ви повинні бути в змозі розмістити білки в певному діапазоні.) Білки, кодовані плазмою, будуть більшими за природний білок через теги епітопу, закодовані плазмідою. Спостережувані розміри те, що ви очікували?

    Інші питання, на які слід звернути увагу в Обговорення:

    • Ви бачили докази індукції промотором GAL1 на гелі або плямі?
    • Як результати західного блоту пов'язані з вашими результатами комплементації? Як ці результати збагачують/послаблюють ваші результати доповнення?
    • Якщо ви не виявили білки на своїй плямі, запропонуйте деякі пояснення. Порівняйте зразки. Чи забезпечують інші зразки хороший позитивний контроль для вашої техніки?