Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

16.4: Мікро-звіт 3- відображення обмежень

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    4187

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Малюнок: Цифра в основі цього мікрозвіту - це гель агарози, що містить рестрикційні дайджести плазмід вашої команди. Зверніться до рекомендацій щодо мікро-звіту 2, щоб дізнатися, як налаштувати цифри за допомогою гелів агарози. Читач повинен мати можливість визначити з гелю та його легенди, яка плазміда показана в кожній смузі і яка рестрикційна ендонуклеаза (РЕ) була використана в кожному дайджесті.

    Матеріали та методи: Щоб відтворити ваші експерименти, читачеві потрібно буде знати, які плазміди та РЕЕ ви використовували, як ви очистили плазміди та деяку інформацію про гелі агарози, які використовуються для карт обмежень. Коли це можливо, зверніться до опублікованих процедур, відзначаючи будь-які зміни до опублікованої процедури. Можливо, ви захочете використовувати підзаголовки для розділу M&M.

    Плазміди: Гени та гомологи MET були клоновані у дві різні плазміди надмірної експресії дріжджів. Використовуйте правильну номенклатуру при зверненні до плазмідам відомих генотипів. Плазмідні імена починаються з нижнього регістру «p» і записуються звичайним шрифтом. Для більшої частини цього звіту вам потрібно буде посилатися на плазміди лише за їх кількістю, оскільки ви все ще намагаєтеся їх ідентифікувати.

    Очищення плазміди: Існує багато різних методів виділення плазмід, тому повідомте читачеві, що ви використовували набір ZyppyTM Plasmid Mimiprep Kit (Zymo Research) з модифікаціями, описаними в лабораторному посібнику. Включіть інформацію про те, як ви оцінювали концентрації плазмідної ДНК, а також концентрацію ДНК кожної очищеної плазміди.

    Обмеження дайджестів: Щоб відтворити ваші експерименти, читач захоче знати, скільки плазмідної ДНК ви використовували в травленні та які REE ви використовували. Співвідношення одиниць РЕ до ДНК важливо для успішних дайджестів. Ваш читач може використовувати інше комерційне джерело ВДЕ, тому також вкажіть кількість ферментних одиниць (U) в реакції. НЕ перераховуйте мкл кожного компонента, використовуваного в реакціях. Обов'язково вкажіть інформацію про температуру і тривалість інкубації.

    Електрофорез агарозного гелю: Дивіться вказівки щодо мікрозвіту 2.

    Результати та обговорення: Проведіть читача через логіку вашого експериментального дизайну. Чому ви обрали саме цей RE? Зверніться до смуг на гелів як до обмежувальних фрагментів. Рестрикційні фрагменти є продуктами перетравлення РЕ.

    Розмір дуже важливий при інтерпретації результатів повторного дайджесту. Слід включити єдину зведену
    таблицю даних з прогнозованими та спостережуваними розмірами фрагментів обмеження. Оцініть розміри фрагментів обмеження шляхом порівняння їх міграції з маркерами. Прогнозовані розміри повинні бути дуже точними, оскільки вони засновані на фактичних послідовностях ДНК, яка має нуклеотидну роздільну здатність. Ваші передбачувані розміри набагато менш точні. Можливо, ви зможете визначити, чи є один фрагмент обмеження меншим або більшим за інший, але ви зможете розмістити фрагменти лише в певному діапазоні розмірів. ПРИМІТКА: кругові плазміди аномально запускаються на гелі агарози. Суперспіральні плазміди швидше мігрують на гелі, ніж лінійна молекула ДНК такого ж розміру. І навпаки, вирізані (одна нитка спіралі була розщеплена, утворюючи розслаблене коло) плазміди мігрують повільніше, ніж лінійна ДНК такого ж розміру. Неповне травлення також може ускладнити результати. Майте на увазі, що кількість смуг на гелі не так важливо, як відмінності в смугах візерунків!

    Чи підтвердили ваші експериментальні результати ваші прогнози? Якщо ваші результати не підтвердили ваші прогнози, вам потрібно врахувати, чи були прогнози неправильними АБО якщо реакції не спрацювали. Неперетравлена плазміда забезпечує контроль для інтерпретації останнього питання.