14.2: Кастинг SDS-PAGE гелі

Last updated
Save as PDF

Page ID: 4583

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Ці інструкції призначені для побудови двох 12% гелів SDS-PAGE з системою BioRad Mini Protean. Один гель буде використаний для фарбування Simply Blue в наступній лабораторії. Другий гель буде використовуватися для вестерн-блоттинга.

Зберіть апарат для лиття гелю

Зберіть компоненти, які вам знадобляться для відливання гелю: висока скляна пластина з прикріпленими 1 мм розпірками, невелика скляна пластина, зелена рамка для лиття і підставка для лиття.
Помістіть зелену рамку для лиття на лавку із зеленими «ногами», міцно спираючись на лавку, а затискачі відкритими (перпендикулярно рамі) та обличчям до вас.
Помістіть дві гелеві пластини в рамку. Вставте вищу розпірну пластину зі стрілками «ВГОРУ» вгору та розпірки, спрямовані до вас, у рамку лиття (логотип BioRad повинен бути звернений до вас). Вставте коротку скляну пластину в передній частині ливарної рами. Між плитами має залишитися простір.
Закріпіть пластини в ливарній рамі, висунувши два ворота рами в сторони. ВАЖЛИВО: нижні краї двох пластин повинні бути врівень з лабораторним стендом, перш ніж затискати рамку закритою, щоб забезпечити водонепроникне ущільнення. Для цього перед закриттям воріт уперти раму вертикально на лавку.
Затисніть ливарну раму зі скляними пластинами в стійку для лиття, при цьому ворота ливарної рами звернені до вас. Повторіть кроки 1-5, щоб підготувати другий гель у кадрі для лиття.
Перевірте, чи правильно запечатані зібрані пластини в ливарному стенді, додавши невелику кількість деіонізованої води в зазор між пластинами. Якщо скляні пластини утримують воду і не протікають, ви готові зробити гелі. Вилийте воду, тримаючи всю платформу для лиття над контейнером для рідких відходів або раковиною. Використовуйте паперові рушники або тканини для поглинання залишкової води. Якщо гель протікає, розберіть раму, просушіть пластини і поверніться до кроку 3.

Приготуйте два розсмоктуючих гелю.

Акриламідні і бісакриламідні мономери є слабкими нейротоксинами. Рукавички і захисні окуляри слід використовувати при роботі з акриламідом.

Зберіть хімічні речовини, які вам знадобляться для заливки гелів. У таблиці нижче наведені кількості кожного хімічної речовини, яке вам знадобиться для заливки двох гелів за допомогою системи Mini-Protean. Полімеризація відбувається швидко, тому обов'язково дотримуйтесь наведеної нижче покрокової інструкції.

Примітка

Каталізатори НЕ повинні включатися в суміш, поки ви не будете готові заливати гелі!

Позначте дві конічні тюбики об'ємом 15 мл «Розсмоктуючий гель» і «Гель для укладання».
Готуйте ТІЛЬКИ розсмоктуючі гелі в цей час. Змішайте розчин акриламіду, рН 8,8 трис буфер і воду, як показано на графіку вище. Змішайте інгредієнти акуратно, намагаючись не вводити повітря. Кисень гальмує полімеризацію акриламідних гелів.
До розсмоктуючої гелевої суміші додають 100 мкл 10% -ного розчину персульфату амонію (АПС). Ген- тло перемішують розчин, намагаючись не вводити повітря. Кисень пригнічує полімеризацію акриламіду.
Додайте 10 мкл каталізатора TEMED. Ще раз акуратно перемішуємо каталізатор, намагаючись не вводити бульбашки повітря. УВАГА: TEMED має неприємний запах. Накрийте тюбик відразу після того, як ви аліквоте цей реагент.
Працюючи швидко, використовуйте пластикову піпетку для перенесення, щоб заповнити простір між двома пластинами, поки розчинний гелевий розчин не досягне висоти трохи вище зелених затискачів на рамці для лиття гелю. Складіть будь-який залишився акриламід в трансферний піпет. (Ви будете знати, що акриламід полімеризувався, коли ви більше не можете виштовхувати акриламід з піпетки.)
Використовуючи трансферну піпетку, додайте деіонізовану воду так, щоб вона м'яко стікала по поверхні поліакриламідної суміші. Водний шар гарантує, що поліакриламідний гель матиме рівну поверхню після того, як він полімеризується.
Дайте гелю полімеризуватися, що займає ~15-20 хвилин. Ви зауважите, що інтерфейс між поліакриламідом і накладкою води тимчасово зникає, поки гель полімер- розмір. Потім між двома шарами утворюється різкий новий інтерфейс, що вказує на те, що полімеризація завершена. (Ви також можете перевірити залишок поліакриламіду в піпетці для перенесення, щоб перевірити, чи не полімеризувався він.)
Коли полімеризація завершена, видаліть воду з верхньої частини розчинного гелю, нахиливши гель в сторону і за допомогою паперового рушника або Kimwipe, щоб відбити воду.

Залийте гелями для укладання

ПРИМІТКА З БЕЗПЕКИ: Переконайтеся, що ви носите окуляри під час заливки гелів для укладання.

Приготуйте гелі для укладання. Змішайте розчин акриламіду, рН 6,8 трис буфер і воду, як показано на графіку вище.
Додайте 30 мкл 10% APS і 7,5 мкл TEMED в суміш для укладання гель-акриламіду. Змішайте вміст, обережно перевернувши трубочку двічі.
Використовуйте піпетку для перенесення, щоб піпетка гелю для укладання поверх розчинного гелю між двома скляними пластинами. Додайте достатню кількість розчину для укладання, поки він просто не досягне верхньої частини маленької пластини.
Акуратно, але швидко опустіть гребінець в положення, стежачи за тим, щоб не ввести бульбашки повітря. (Логотип Bio Rad на гребінці повинен бути звернений до вас.) Додавання гребінця змусить якийсь розчин вийти з гелю, але це нормально. Якщо бульбашки повітря потрапили під гребінцем, видаліть гребінець і переставте її.

Збережіть гелі SDS-PAGE

1. Акуратно зніміть гелі з підставки для лиття, а потім з їх зелених рамок.

2. Зберігаючи гребінці в гелі, загорніть гелі в вологий паперовий рушник. Потім оберніть гелі в поліетиленову плівку для використання в пізніших лабораторіях. Гелі будуть зіпсовані, якщо їх не тримати мокрими і правильно загортати!