14.1: Фон

SDS-PAGE широко використовується для аналізу білків в складних екстрактах. Найбільш часто використовувані методи походять від переривчастої системи SDS-PAGE, вперше описаної Laemmli (1970). Система насправді складається з двох гелів - розсмоктуючого (він же працює) гелю, в якому білки розчиняються на основі їх молекулярних мас (MW) і укладального гелю, в якому концентруються білки перед введенням розчинного гелю. Відмінності в складах гелю для укладання, розсмоктуючого гелю та буфера електрофорезу виробляють систему, яка здатна тонко розчиняти білки відповідно до їх MW.

Гелевий електрофорез макромолекул

При гелевому електрофорезі електричне поле використовується для переміщення заряджених молекул через матрицю
з полімеризованого речовини, такого як агароза або поліакриламід. Швидкості, з якими окремі молекули рухаються через гель, залежать від властивостей як системи поділу, так і самих молекул. Гелеві матриці пронизані мережами пір, по яких рухаються молекули. Величина опору, яку матриця представляє руху молекули, залежить від діаметра пори, а також розміру та геометрії молекули. Дослідники можуть контролювати розмір пори, регулюючи концентрацію мономера гелю в певному діапазоні. Загалом, менші, більш сильно заряджені молекули мігрують швидше через гелі, ніж більші або менш заряджені молекули. На рухливість молекули також впливає буферна система і сила електрофоретичного поля, що використовується для поділу.

Ви вже використовували електрофорез агарозного гелю для поділу молекул ДНК. Нагадаємо, що розмір лінійної молекули ДНК можна оцінити за швидкістю, з якою вона рухається через гель агарози, оскільки молекули ДНК мають рівномірне відношення заряду до маси. Білковий електрофорез дещо складніше, ніж електрофорез ДНК. Білки набагато менше молекул ДНК, тому для їх поділу використовують поліакриламідні гелі. Крім того, білки набагато більш структурно різноманітні, ніж ДНК, тому хімічні обробки (див. Нижче) використовуються для додання білкам рівномірної геометрії і співвідношення заряду/маси.

Хімія полімеризації акриламіду

Поліакриламідні гелі, що використовуються для поділу білків, утворюються хімічною полімеризацією акриламіду та зшиваючим реагентом N, N'метиленебісакриламідом (протилежна сторінка). Дослідники здатні контролювати розмір пір в гелі шляхом регулювання концентрації акриламіду, а також співвідношення акриламіду до бісакриламіду. Підвищення концентрації акриламіду або бісакриламіду, утримуючи при цьому постійну іншу концентрацію, зменшить розмір пор гелю. Полімеризація відбувається через вільних радикалів кисню, які вступають в реакцію з вініловими групами в акриламіді і бісакриламіді, як показано на малюнку нижче. Кисневі радикали генеруються з каталізатора персульфату амонію (APS), коли він реагує з другим каталізатором N, N, N ', N'-тетраметилетилендіамін (TEMED).

Полімеризація акриламідного гелю.

Персульфат амонію і ТЕМЕД каталізують полімеризацію акриламідних і біс-акриламідних мономерів в зшиту мережу.

Білки денатурують перед електрофорезом

У порівнянні з молекулами ДНК білки структурно дуже різноманітні. Білки показують величезну різницю в їх амінокислотних складах і в розподілі амінокислот
в їх складчастих структурах, особливості з важливими наслідками для електрофорезу. Нагадаємо, що білки - це суміші гідрофобних і гідрофільних амінокислот і що первинна послідовність білка визначає його кінцеву складену форму. Через гідрофобного ефекту поверхні білків
білків мають більш високу частоту полярних і заряджених амінокислот, ніж інтер'єри, де переважають гідрофобні залишки. Складені білки припускають багато різних геометрій, а їх поверхні є мозаїками щодо розподілу R груп з різною хімією. Оскільки білки настільки різноманітні щодо їх поверхневих зарядів та геометрії, молекулярні маси згорнутих білків не можуть бути просто визначені швидкістю їх міграції в електричному полі. Позитивно і негативно заряджені білки мігрували б в різні боки!

Для розчинення білків у зразку відповідно до їх розміру дослідники повинні перетворити білки до однорідної геометрії і надати білкам рівномірне співвідношення заряду/маси. У SDS-PAGE розчин полягає в денатуруванні білків шляхом кип'ятіння їх з аніонним миючим засобом, додецилсульфатом натрію (SDS) та 2-меркаптоетанолом. Поєднання тепла і миючого засобу достатньо, щоб розірвати безліч нековалентних зв'язків, які стабілізують білкові складки, а 2-меркаптоетанол розриває будь-які ковалентні зв'язки між залишками цистеїну. Як і інші миючі засоби, SDS - амфіпатична молекула, що складається з гідрофобної 12-вуглецевого ланцюга і гідрофільної сульфатної групи. Вуглеводневий ланцюг SDS пронизує внутрішню частину білка і зв'язується з гідрофобними групами, зменшуючи білок до випадкової котушки, покритої негативно зарядженими молекулами миючого засобу по всій його довжині. Денатуровані білки пов'язують досить багато SDS, що становить ~ 1,4 г SDS/г білка, або ~ один SDS mol- ecule на кожні дві амінокислоти.

Розриви між укладанням і запуском гелів лежать в основі розділюючої здатності гелів SDS-PAGE

Система SDS-PAGE Laemmli (1970) може бути con sidered 3-компонентної системи. Укладальні та запущені (розсмоктуючі) гелі мають різні розміри пор, іонну силу та рН. Третім компонентом є буфер електрофорезу (25 мМ трис, 192 мМ гліцин, 0,1% SDS, рН ~ 8,3), який містить велику кількість гліцину. Стан іонізації гліцину має вирішальне значення для поділу. При нейтральному рН гліцин є цвіттеріон, з негативно зарядженою карбоксильною групою і позитивно зарядженою аміногрупою. pK _a аміногрупи становить 9,6, що значно перевищує рН камерного буфера. Отже, дуже мало гліцину має негативний заряд в камерному буфері або укладанні гелю, і значна іонізація не відбувається до тих пір, поки гліцин не потрапить в більш лужну pH 8,8 середу працюючого гелю. Давайте простежимо за прогресом зразків протеїну під час SDS-PAGE, щоб побачити, як відмінності в складі цих трьох компонентів генерують високу роздільну здатність гелів SDS-PAGE.

Буфер для зразків, що використовується для SDS-PAGE, містить барвник для відстеження, бромфенол-синій (BPB), який буде мігрувати з переднім краєм білків, що відокремлюються на гелі. Буфер для зразків е також містить гліцерин, який дозволяє зразкам білка осідати на дно гелевих лунок. Гель вертикально розташований в апараті електрофорезу і покритий камерним буфером, що містить гліцин (праворуч, затінений).

Після подачі напруги іони хлориду в буфері зразка і укладання гелю швидко рухаються до позитивного полюса, утворюючи передній край рухомого іонного фронту. Молекули гліцину мають дуже мало заряду в укладанні гелю, тому вони мігрують в задній частині рухомого іонного фронту. Ця різниця в рухливості хлориду та гліцину встановлює крутий градієнт напруги в гелі для укладання, який змітає вздовж негативно заряджених комплексів Білка-SDS. Великі пори гелю для укладання представляють дуже малу стійкість до руху білково-SDS-комплексів, які потім «укладають» в дуже концентровану область на межі розділу між бігом і укладанням гелів (праворуч). Білково-SDS-комплекси залишаються концентрованими на межі розділу, поки повільно мігруючі молекули гліцину не досягнуть межі між двома гелями.

Різкі зміни відбуваються в міру потрапляння іонів гліцину в працюючий гель. РН біжить гелю ближче до рКа гліцинових аміногруп, тому значна частка молекул гліцину припускають негативний заряд. Негативно заряджені молекули гліцину починають рухатися з тією ж швидкістю, що і іони хлориду, тим самим усуваючи різницю напруги, яка контролювала рухливість білка через гель для укладання. Пори в запущеному гелі набагато менше, ніж у гелю для укладання, тому пори мають стійкість до тертя до міграції білків. Білки починають мігрувати з різною швидкістю, через просіюючих властивостей гелю. Менші білково-SDS-комплекси мігрують швидше, ніж більші комплекси білка- SDS (праворуч). У певному діапазоні, визначеному пористістю гелю, швидкість міграції білка в біжить гелі обернено пропорційна логарифму його МВт.

Білки візуалізуються плямами.

За рідкісним винятком, природні білки невидимі на гелі SDS-PAGE. Отже, дослідники часто використовують попередньо забарвлені норми білка для контролю приблизних положень білків під час електрофорезу. Попередньо забарвлені стандарти виробляються шляхом ковалентного приєднання великої кількості хромофорів до білка. Додавання хромофорів збільшує MW білка, а також виробляє більше дифузних смуг на
гелі. Дифузність смуг відображає зміну кількості молекул барвника, прикріплених до окремих молекул білка. Ми будемо використовувати попередньо витримані стандартні білкові сходи в наших гелі, так що ви зможете візуалізувати поділ білка, що відбувається. Однак дріжджові білки не будуть видні, оскільки вони не були модифіковані хромофорами.

Щоб візуалізувати положення білків після завершення електрофорезу, дослідники фарбують гелі різними барвниками, які зв'язуються нековалентно і з дуже малою специфічністю до білків. Під час процесу фарбування білки також «закріплюються» в гелі, а це означає, що білки стають нерозчинними і не здатні дифузіровать з гелю. У наших експериментах ми будемо використовувати Simply Blue, колоїдну суспензію Coomassie Brilliant Blue G-250. Brilliant Blue G-250 зв'язує білки неспецифічно через велику кількість іонних і Ван дер Ваальсів взаємодій. При цій процедурі гелі змивають водою для видалення буферних солей, використовуваних для електрофорезу, а потім обробляють колоїдною суспензією G-250. Білкові смуги з'являються швидко, і при необхідності гелі можна утримувати деіонізованою водою, щоб знизити гелевий фон. Інтенсивність фарбування Brilliant Blue вважається кількісною процедурою, оскільки за деякими винятками інтенсивність забарвленої смуги прямо пропорційна кількості білка в смузі.

Молекулярні маси білка можна розрахувати по їх міграції на гелі

Розміри білків в екстракті можна розрахувати, порівнюючи їх міграцію з набором стандартних білків, що працюють на тому ж гелі. Дослідники вибирають стандартні білки, які будуть добре розчинені на конкретному гелі, який вони працюють. Наприклад, дослідник, який використовує гель 7,5%, підбере стандарти з більш високими молекулярними масами (MW), ніж дослідник, який використовує 15% гель, який краще підходить для аналізу дрібних білків. Принципи, що використовуються для оцінки MW, ті ж, що використовуються для електрофорезу агарозного гелю. Ділянка колоди ₁₀ МВт стандартних білків проти відстані, що кожен білок мігрував на гелі дасть пряму лінію в області, де гель має хорошу роздільну здатність. (Примітка: MW - це не те саме, що маса білка. MW - це безрозмірний термін. Наприклад, міоглобін має масу 16,7 кДа і МВт 16 700.) Розміри невідомих білків можна оцінити шляхом інтерполяції експериментальних значень на графіку стандартних білків. Білки, молекулярні маси яких виходять за межі цього діапазону, не будуть добре розчинені на гелі.

На малюнку нижче показано кілька пунктів, розглянутих вище. Ті самі набори нефарбованих і попередньо забарвлених стандартів білка були розділені на 12% або 15% SDS-PAGE гелі. Попередні стандарти в смугах 1-5 видно без фарбування, але вони стають набагато більш вираженими після фарбування. Неокрашенний стандарт в смузі 6 вимагає фарбування, щоб стати видимим, але смуги набагато більш дискретні і дадуть більш достовірні значення при розрахунку MW невідомих білків, оскільки хромофори не прикріпилися до білків. Дані в смугах 2-5 також демонструють, що фарбування Brilliant Blue є кількісною процедурою, оскільки інтенсивність смуг в кожній смузі зростає прямо пропорційно кількості білка в смузі.

Аналізуючи свої експериментальні дані, не забудьте врахувати додаткові амінокислоти, які були додані під час процедури клонування. Білки Met, з якими ви працюєте, - це злиті білки з додатковими амінокислотами в білках C-termini Met. Плазміда BG1805 кодує епітопи HA та His6, а також домен, що зв'язує імуноглобін ZZ. Разом ці послідовності додають валопінг ~19 кДа до очікуваної маси протеїнів S. cerevisiae Met (Gelperin et al., 2005). Плазміда PyES2.1 кодує 33 амінокислоти, які додаються до клонованих ORF. Додаткові послідовності включають тег епітопу V5 та мітку очищення (His) ₆ на C-termini надмірно експресованих білків. Разом ці амінокислоти додають ~ 5 кДа до розміру білка.

Примітка

МВт контрольного білка LaCZ без епітопу V5 становить ~ 120 кДа. Оскільки це такий великий білок, отримати точну оцінку його МВт буде дуже складно.

​​​​​​​