Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

13.4: Вправа 2 - Підготовка екстрактів клітин

  • Page ID
    4830
  • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Підготуйте клітини до екстракції

    1. Зберіть 6 культур вашої команди і зверніть увагу, які культури містять глюкозу, а які культури містять галактозу.
    2. Визначте концентрацію клітин або кожну культуру. Вихрові трубки і перенесіть 100
      мкл кожної клітинної культури в 900 мкл деіонізованої води. Виміряйте OD600 культур в спектрофотометрі. Зверніть увагу на значення в блокноті. Ви будете звертатися до них пізніше при інтерпретації гелів SDS-PAGE (Глава 14).
    3. Перенесіть 1,5 мл ваших культур у мічені мікроцентрифужні пробірки. Збирайте клітини за допомогою центрифугування протягом 1 хвилини за допомогою мікроцентрифуги на максимальній швидкості. Вийміть і викиньте супернатант.
    4. Промийте клітини. Додайте в кожну пробірку по 1 мл деіонізованої води. Відновите клітинні гранули, обережно втягуючи клітини всередину та з наконечника мікропіпетки, дбаючи про запобігання передчасному лізису клітин. Цей етап полоскання видаляє білки з культурального середовища, які можуть забруднити клітинну гранулу. Центрифуга знову протягом 1 хвилини на максимальній швидкості.
    5. Відмовтеся від супернатанта і пересушіть клітини в 100 мкл деіонізованої води.

    Готуємо білковий екстракт

    1. Додайте 100 мкл 0.2N NaOH в кожну трубку і інкубуйте клітини протягом 5 хвилин при кімнатній температурі. (Додавання NaOH не лизує клітини, але робить їх більш проникними і більш крихкими.)
    2. Плетите клітини знову в мікроцентрифугу. Вийміть і викиньте супернатант. (Білки, які вас цікавлять, знаходяться в гранулах.)
    3. Пересушити клітини в 50 мкл 2 X SDS-PAGE буфер.* Переконайтеся, що трубки щільно закриті. ВІДРАЗУ ж помістіть трубочки на киплячу водяну баню. Залиште осередки на водяній бані на 3 хвилини. Таке лікування ефективно денатурує білки. Дріжджові клітини містять багато протеаз, які можуть погіршити інші клітинні білки, тому важливо, щоб протеази були денатуровані, перш ніж вони матимуть шанс атакувати інші клітинні білки.
      ПРИМІТКА: Буфер зразка 2 X SDS-PAGE містить 2-меркаптоетанол (також відомий як b -меркаптоетанол або BME). Використовуйте відповідну обережність і швидко працюйте при поводженні з цим реагентом. БМЕ - летючий реагент з сильним запахом, що нагадує тухлу рибу.
    4. Після закипання зберігайте зразки в морозильній камері про запас.

    * 2 X SDS-PAGE буфер зразка складається з:

    120 мМ трис/HCl, рН 6,8
    10% гліцерину (гліцерин значно щільніше води) 4% SDS
    8% 2-меркаптоетанол
    0,004% бромфенол синій (барвник для відстеження електрофорезу)