Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

13.2: Приготування білкових екстрактів з дріжджових клітин

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    4866

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Білки складають близько половини сухої маси більшості клітин і включають в себе безліч структурних білків, каталізаторів, рецепторів і сигнальних білків, відповідальних за функцію клітин. Щоб зрозуміти функцію клітин, вчені часто хочуть проаналізувати білковий склад клітин. Аналіз білка починається з приготування клітинного екстракту, в ідеалі в умовах, що мінімізують деградацію білка. Підготовка хороших клітинних екстрактів - це щось мистецтво, і під час розробки протоколу вилучення потрібно враховувати багато факторів.

    У цьому курсі ми будемо аналізувати функцію білка в дріжджах. Середня гаплоїдна дріжджова клітина містить ~ 6 пг білка (Sherman, 2002). Хоча дріжджові клітини мають багато переваг для генетичних досліджень, їх, як відомо, важко використовувати для біохімічних досліджень. Тим не менш, вченим вдалося розробити процедури вилучення дріжджових білків, які обходять ці експериментальні бар'єри.

    Першим міркуванням при розробці процедури екстракції є компартменталізація клітин. Всі клітини оточені плазматичною мембраною, а еукаріотичні клітини містять додаткові мембрани, які оточують органели. Грибкові клітини також мають клітинні стінки на основі целюлози, які захищають клітини від механічних і осмотичних сил. Процедури екстракції клітин починаються з порушення плазматичної мембрани і клітинної стінки механічними та/або хімічними обробками. Механічне порушення дріжджових клітин повинно бути досить енергійним, оскільки їх клітинні стінки дуже жорсткі. Механічні методи, які зазвичай використовуються для порушення дріжджів, включають ультразвукову обробку, високий тиск та «побиття» скляними намистинами. Ці енергійні процедури ризикують пошкодити білки через тепло і піноутворення, що утворюються під час процесів.

    Хімічні процедури пропонують більш м'яку альтернативу механічним порушенням для приготування екстрактів. Хімічні процедури екстракції часто включають миючі засоби, які солюбілізують мембранні ліпіди, тим самим дозволяючи білкам дифузувати з клітини. Більшість миючих засобів не розрізняють внутрішньоклітинні та плазматичні мембрани, тому екстракт миючого засобу зазвичай містить білки з декількох органел, а також цитоплазматичні білки. У цьому експерименті ми будемо використовувати додецилсульфат натрію (SDS) як миючий засіб. SDS - це денатурующий миючий засіб, який розгортає білкові структури, розриваючи тисячі слабких зв'язків, які зазвичай стабілізують білкові структури. Білки перетворюються у випадкові котушки, покриті по їх довжині негативно зарядженими молекулами SDS.

    При приготуванні екстрактів необхідно подбати про захист білків від деградації клітинними протеазами. Клітини містять протеази з безліччю різних специфік, які відповідають за нормальний оборот білків в клітині. Порушення клітин часто вивільняє протеази з таких відсіків, як лізосоми, забезпечуючи їм доступ до цитоплазматичних білків. Дріжджі, як відомо, багаті протеазами. У неушкодженій дріжджовій клітині багато з цих протеаз розташовані в дріжджової вакуолі, яка є аналогом лізосоми ссавців. Протокол, який ми будемо використовувати в цьому курсі (Amberg
    et al. , 2005) використовує комбінацію тепла та SDS для швидкого знищення дріжджових протеаз. Клітинні суспензії відразу ж занурюються в киплячу водяну баню після додавання СДС. Екстракти, приготовані цим методом, підходять для електрофорезу і аналізу вестерн-блот.