Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

11.5: Вправа 3 - Проаналізуйте обмеження перетравлення на гелі агарози

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    4248

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    1. Плануйте свій гель. Кожна група студентів приготує по одному гелю агарози з 8 доріжками зразків.
    • Кожен студент пробіжить по одній смузі з неперетравленої плазмідою, а другу смугу з плазмідою, яка була перетравлена з РЕ. Важливо запустити смугу з неперетравленою плазмідою, щоб визначити, чи ефективно RE розщеплювали плазміди. Майте на увазі, що неперетравлені плазміди будуть електрофорез з аномальними розмірами через їх перекручених структур.
    • Одна смуга повинна бути зарезервована для стандартів молекулярної ваги.
    • Запишіть в блокноті, як ви плануєте завантажувати свій гель.

    2. Приготуйте 1% гель агарози в буфері TAE, як описано в розділі 8.

    3. Підготуйте зразки для електрофорезу. Використовуйте весь рестрикційний дайджест на гелі. Для неперетравлених плазмідних зразків встановлюють пробірки, що містять 7 мкл плазміди та 3 мкл деіонізованої води.

    ВАЖЛИВО: Поверніть будь-яку невикористану плазміду в морозильну камеру. Ви будете використовувати плазміди для перетворення дріжджів у більш пізній лабораторії.

    Комбінат:

    10 мкл обмеження перетравлення або неперетравленої плазміди

    5 мкл деіонізованої води

    3 мкл 6X буфер зразка

    4. Завантажте та запустіть гель агарози, як описано в розділі 8.

    5. Оцініть концентрації ДНК у ваших плазмідних препаратах. Після того, як гель був запущений і забарвлений, спробуйте оцінити концентрацію ДНК у ваших трьох плазмідних препаратах, використовуючи стандарти розміру як еталон. Кожен з маркерів, за винятком маркера 3 кб, містить ~40 нг. Смуга 3 кб містить 125 нг. Використовуйте ці значення, щоб візуально оцінити кількість ДНК у вашій смузі. Правильно за обсягом проби в смузі розрахувати концентрацію ДНК в кожному плазмідному препараті. (Хоча це значення є неточним, це значення буде корисним для розрахунку ефективності перетворення в наступній лабораторії.)