Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

11.4: Вправа 2 - Налаштування дайджестів обмежень

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    4217

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Концентрації РЕ та плазмідної ДНК повинні бути узгоджені в рестрикційному дайджесті. Виробники аналізують активність кожної партії РЕ і виражають активність в одиницях активності ферментів на мкл. Одиниця активності (U) оцінюється в стандартизованому аналізі для вимірювання концентрацій РЕ. Рестрикційні дайджести зазвичай встановлюються таким чином, щоб містити принаймні 2-5 U на мкг плазмідної ДНК. Набори ZyppyTM зазвичай дають плазмідні концентрації в діапазоні від 10 до 30 нг/мкл. (Ви зможете оцінити концентрацію плазмідної ДНК, коли будете запускати гелі агарози в наступній лабораторії.) У цій лабораторії ми використовуємо 7 мкл ДНК плазмідного мініпрепу в кожній реакції та 1 U RE. Цього має бути більш ніж достатньо RE, щоб забезпечити повне перетравлення плазмідної ДНК.

    У вашому лабораторному блокноті зверніть увагу, які RE (и) ви вирішили використовувати.

    • Підготуйте окрему трубку для кожного з ваших RE дайджестів.
    • З'єднайте наступні компоненти в кожному тюбику в порядку, перерахованому:

      7,0 мкл плазміди

      1.0 мкл 10X CutSmart TM буфер або буфер 10X 3.1 (лише для дайджестів HinCII)

      2,0 мкл (1,0 U) рестрикційний фермент

    Загальний обсяг реакції повинен становити 10 мкл.

    • Переконайтеся, що компоненти кожної реакції добре перемішуються на дні трубки, центрифугуючи їх протягом декількох секунд в мікроцентрифузі.
    • Інкубуйте зразки при температурі 37° C протягом не менше 2 годин.
    • Зберігайте реакції в морозильній камері.
    Примітка

    Вправа 3 буде виконана на наступному лабораторному занятті.