Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

11.3: Вправа 1 - Плануйте дайджест обмежень

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    4234

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Призначте кожній людині у вашій групі іншу плазміду для аналізу.

    Спочатку вам потрібно зібрати повні послідовності ваших плазмід надмірної експресії, об'єднавши послідовності плазміди та генів MET. Нагадаємо, що гени S. cerevisiae були клоновані у вектор PbG1805 і що гени S. pombe та LaCZ були клоновані у вектор PyES2.1. Потім ви створите карту обмежень, яку можна використовувати для прогнозування фрагментів обмеження, що генеруються при травленні RE. Для створення карти ми будемо використовувати один з декількох онлайн-інструментів, який доступний на веб-сайті New England Biolabs, комерційного постачальника ВДЕ.

    Скористайтеся таблицею нижче, щоб розрахувати довжину вашої плазміди під час виконання перших кількох кроків цієї вправи.

    1. Знайдіть послідовність кодування вашого гена.

    • Відкрийте запис для вашого гена MET або його гомолога на SGD або Pombase відповідно.
    • Знайдіть кількість амінокислот у вашому білку. Помножте це число на 3, щоб знайти кількість нуклеотидів в CDS. Додайте це число в таблицю вище.
    • Знайдіть послідовність CDS для вашого гена. Ви вставите цю послідовність до кінця послідовності плазмід на кроці 2.
    • Послідовність PyES2.1- LaCz розміщена на Canvas, тому кроки 1 та 2 вже зроблені для цієї плазміди. Зауважте, що плазмідний ген LaCZ був модифікований з природних генів LaCZ.

    2. Зберіть повну нуклеотидну послідовність вашої плазміди.

    • Відкрийте документ Word, що містить послідовність векторів PyES2.1, розміщену на Canvas. Плазмідні послідовності нумеруються так, що промотор GAL1 знаходиться на 3'-кінці послідовності ДНК.
    • Скопіюйте CDS з SGD або Pombase і вставте його в кінці послідовності плазмід.
    • Видаліть останні три нуклеотиди CDS, які складають стоп-кодон гена. Надекспресійні плазміди призначені для кодування злитих білків із С-кінцевими екстенсіями. (Примітка: стоп-кодон в послідовності LaCZ був видалений виробником.)

    3. Підготуйте карту обмежень повної плазмідної послідовності.

    • Вставте послідовність з кроку 2 у вікно пошуку інструмента NebCutter: nc2.neb.com/nebcutter2/
    • Поставте прапорець, щоб вказати, що плазміда є ЦИРКУЛЯРНОЮ, а не лінійною.
    • Можливо, ви також захочете дати своїй плазміді ім'я. Сайт NEB буде зберігати ваші запити протягом 24 годин, що може бути дуже зручно. Натисніть «Надіслати».
    • Інструмент пошуку поверне результати для незрозумілої кількості відновлюваних об'єктів. Переважна більшість ділянок РЕ не є корисними, оскільки фрагменти занадто великі або занадто малі, фермент відсутній в лабораторії, або ендонуклеаза чутлива до метилювання ДНК (що може бути непередбачуваним).

    4. Виконуйте спеціальні дайджести з ферментами, які виглядають перспективно.

    • Натисніть посилання на власний дайджест. Це призводить до діаграми ВДЕ, які розрізають плазміду, місця їх розпізнавання, кількість місць розпізнавання та кількість активності ферментів у

      кожен з чотирьох буферів.

    • Проаналізуйте фрагменти, які будуть створені чотирма RES нижче, встановивши прапорець і натиснувши зелену кнопку Надіслати.
      Чаді Хінчі Скай Xbai

      (Примітка: Можуть бути деякі зміни до цього списку доступних ВДЕ перед лабораторією.)

    5. Підготуйте таблицю, що підсумовує карти обмежень для ваших трьох плазмід.

    • Заповніть таблицю нижче, вказавши розміри фрагментів обмеження, що генеруються зкожним RE.
    • Включіть загальну довжину плазміди в таблицю. Сума довжин фрагментів обмеження повинна підсумувати до цього числа.

    6. Виберіть RE, який відрізняє ваші три плазміди.
    Команда повинна використовувати таблицю даних вище, щоб вибрати RE, який найкраще дозволяє розрізнити три плазміди. Ми будемо аналізувати фрагменти обмеження на 1% агарозних гелів, які добре справляються з розсмоктуванням фрагментів розміром від ~ 500 бп до ~ 5000bp. Зверніться до малюнка в розділі 8, де показано розподіл маркерів молекулярного розміру на 1% агарозних гелів. Виберіть RE, який буде виробляти дайджести обмежень з приємним діапазоном розмірів фрагментів.