Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

11.2: Молекули ДНК мають унікальні карти обмежень

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    4249

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Послідовність молекули ДНК визначає розподіл місць розпізнавання для ВДЕ. Були описані сотні ВДЕ з унікальними характеристиками, тому дослідники можуть використовувати розподіл цих місць розпізнавання в молекулі ДНК для побудови «карти» послідовності. У цих експериментах зразки ДНК перетравлюються різними РЕЕ, щоб отримати карту рестрикції, колекцію менших фрагментів рестрикції, які були розщеплені з обох кінців RE. Потім молекули в дайджесті відокремлюються електрофорезом агарозного гелю (глава 8). З розмірів рестрикційних фрагментів, які дозволені на гелі, дослідники здатні ідентифікувати вихідну молекулу ДНК, яка використовується в рестрикційному дайджесті.

    Ретельне планування потрібно для значущих карт обмежень. Першим кроком в експерименті з картографуванням є виявлення розмірів рестрикційних фрагментів, які будуть генеруватися з молекули ДНК мішені з різними RES. Різноманітні програмні програми генерують ці карти обмежень і надають табличні дані з деталями про довжину і положення фрагментів рестрикції в послідовності ДНК. Список ферментів, які скорочують ту чи іншу послідовність, завжди вражає,
    але практичними з метою експерименту зазвичай виявляються лише кілька ферментів. Вибираючи RES для карти обмежень, слід враховувати багато речей:

    • Скільки фрагментів обмежень буде згенеровано?
    • Які передбачувані розміри фрагментів обмеження?
    • Чи будуть чітко дозволені всі фрагменти обмеження на 1% гелі агарози?
    • Чи буде RE генерувати характерний набір фрагментів з кожного зразка ДНК?
    • Наскільки дорого коштує РЕ?

    У цій лабораторії ви будете використовувати програму NEB Cutter для ідентифікації ділянок ВДЕ в плазмідних послідовностях. (NEB Cutter надається Новою Англією Biolabs, комерційним постачальником ВДЕ.)
    Ви згадаєте, що плазміди - це перекручені кола. Травлення за допомогою РЕ відкриває плазміду і розслабляє її структуру. (Без травлення РЕ видимі розміри плазмід на гелі агарози ненадійні.) Плазміди, які ми використовуємо для наших експериментів, - це складні плазміди на основі PyES2.1 (5886 bp). Шукайте результати RE, які генеруватимуть чітко помітні фрагменти обмежень з ваших плазмід. Настійно рекомендується вибрати однаковий RE для всіх трьох дайджестів! Оскільки плазміди засновані на PyES2.1, не дивно спостерігати деякі загальні фрагменти обмежень у цих дайджестах.

    Обробка обмежувальних ендонуклеаз в лабораторії

    ВДЕ, які ми використовуємо в лабораторії, є високоочищеними (і дорогими!) білки, які були очищені від рекомбінантних бактерій. Як і всі ферменти, кожен RE функціонує оптимально при певному наборі умов реакції, включаючи температуру, рН та концентрації іонів металів і солей. Виробник наших ВДЕ розробив буфери, які підтримують високий рівень активності для більш ніж 200 ВДЕ. Кожен буфер містить 0,1 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну (BSA), рясний білок з коров'ячої сироватки, який допомагає стабілізувати схильні до денатурації ВДЕ та запобігати неспецифічному всмоктуванню ВДЕ в пробірки та наконечники.

    Як і всі ферменти, ВДЕ схильні до спонтанної денатурації, тому з REs потрібно звертатися обережно. (Для порівняння, ДНК є виключно стабільною молекулою.) Швидкість дезатурації білка збільшується з температурою і на стиках сполучення повітря/вода. Деякі прості запобіжні заходи дозволять мінімізувати денатурацію. Дотримуйтесь таких простих правил, коли будете готувати дайджести обмежень:

    • Використовуйте рекомендований буфер для конкретного RE.
    • Тримайте реакції на льоду, поки не почнеться інкубація.
    • Будьте обережні, щоб не вводити бульбашки. Не використовуйте вихровий змішувач.
    • Додайте РЕ в останню чергу, після того, як будуть зібрані інші компоненти реакційної суміші.