11.1: Обмеження ендонуклеаз

Last updated
Save as PDF

Page ID: 4218

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Системи обмеження/модифікації бактерій захищають від загарбників

Відкриття рестрикційних ферментів, або рестрикційних ендонуклеаз (РЕЕ), було вирішальним для розвитку молекулярного клонування. ВДЕ відбуваються природним чином у бактерій, де вони спеціально розпізнають короткі ділянки нуклеотидів у ДНК та каталізують дволанцюгові розриви на місці розпізнавання або поблизу
нього (також відомий як місце обмеження). На сьогоднішній день описані тисячі ВДЕ з різними особливостями. Ви можете задатися питанням, чому бактерії містять ці потенційно руйнівні ферменти. ВДЕ є частиною системи захисту бактерій від чужорідних ДНК, таких як інфекційний бактеріофаг. Ділянки РЕ у власній ДНК бактерії захищені від розщеплення, оскільки вони були модифіковані метилтрансферазою, яка спеціально модифікує ділянки РЕ. Комбіновані дії ендонуклеази і метилтрансферази називають системою обмеження/модифікації. Сьогодні більшість наявних у продажу ВДЕ не очищаються від своїх природних джерел. Натомість ВДЕ зазвичай виділяють з бактерій, які надмірно експресують велику кількість ВДЕ з плазмід. Ці рекомбінантні ВДЕ часто були розроблені молекулярними біологами, щоб включити зміни амінокислот, які підвищують каталітичну активність або стабільність РЕ.

Щоб зрозуміти, як працюють ВДЕ, ми будемо використовувати eCoRi, один з найбільш вивчених ВДЕ, як приклад. Хоча назви окремих РЕЗ можуть звучати трохи як дитячі розмови, номенклатура насправді дуже систематична і базується на її біологічному джерелі. EcoRi природним чином міститься в штамі RY13 кишкової палички. Його назва починається з роду та виду (Eco для E. coli), за яким слідує ідентифікатор штаму (R для RY13), і закінчується римською цифрою, яка відрізняє різні RE, знайдені в штамі. Штам RY13 кишкової палички містить множинні РЕЕ, але тільки eCoRi і eCoRV, широко використовуються в молекулярній біології.

Рестрикційні ферменти розщеплюють специфічні ділянки в ДНК

Рестрикційні ферменти, такі як eCoRi, часто називають 6-різаками, оскільки вони розпізнають 6-нуклеотидну послідовність. Припускаючи випадковий розподіл A, C, G і Ts в ДНК, ймовірність прогнозує, що місце розпізнавання для 6-різака має відбуватися приблизно один раз на кожні 4096 bp (4 ⁶) в ДНК. Звичайно, розподіл нуклеотидів в ДНК не є випадковим, тому фактичні розміри фрагментів ДНК, вироблених eCoRi, коливаються від сотень до багатьох тисяч пар основ, але середній розмір близький до 4000 б.п. Фрагменти ДНК такої довжини корисні в лабораторії, так як вони досить довгі, щоб містити послідовність кодування білків і добре розчиняються на агарозних гелів.

eCoRi розпізнає послідовність G A A T T C в подвійній багатонитковій ДНК. Ця послідовність розпізнавання є паліндром з дворазовою віссю симетрії, тому що читання від 5' до 3' на будь-якому пасмі спіралі дає однакову послідовність. Паліндромний характер місця обмеження більш очевидний на малюнку нижче. Точка в центрі місця обмеження позначає вісь симетрії. eCoRi каталізує гідроліз фосфодіефірних зв'язків між G і A на обох нитках ДНК. Рестрикційні фрагменти, що генеруються в реакції, мають короткі однониткові хвости на 5'-кінцях. Ці кінці часто називають «липкими кінцями» через їх здатність утворювати водневі зв'язки з комплементарними послідовностями ДНК.

РеЕ іноді називають молекулярними ножицями через їх здатність генерувати фрагменти обмеження, які закінчуються визначеними послідовностями. Ці «липкі кінці» важливі для технології рекомбінантної ДНК, оскільки вони дозволяють дослідникам будувати дизайнерські молекули ДНК. Будь-які дві молекули ДНК з сумісними липкими кінцями можуть бути з'єднані між собою лігазами ДНК, які служать «пастою» шляхом повторного герметизації порушених фосфодіефірних зв'язків. Ми не будемо генерувати рекомбінантні молекули в цьому класі, але важливо розуміти їх значення для сучасної біології. Розглянемо плазміди PbG1805 і PyES2.1. З плазмідних карт у Главі 10 видно, що ці складні плазміди були побудовані шляхом зшивання послідовностей ДНК з еволюційних різних джерел.