8.1: Фон

Last updated
Save as PDF

Page ID: 4898

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Агарозні гелі забезпечують простий метод аналізу препаратів ДНК. Молекули ДНК мають однакове співвідношення заряду/маси, що надає аналогічні електрофоретичні властивості лінійним молекулам ДНК широко різної довжини. Ми будемо використовувати «молекулу» для позначення лінійного фрагмента ДНК, але майте на увазі, що одна «молекула» ДНК може містити послідовності декількох генів або частин генів.

Агарозні гелі - пористі матриці

Агароза - це полісахарид, очищений від червоних водоростей, або морських водоростей. Агароза більш високоочищена (і значно дорожче!) ніж агар, який отримують з тієї ж Знімок екрана 2019-01-03 о 11.03.18 PM.png морської капусти. Молекули агарози являють собою довгі лінійні полімери повторюваного дисахариду D-галактози і 3,6-ангідро-α-L-галактопіранози (праворуч). Типова молекула агарози містить більше ста субодиниць. Агароза, яка використовується для електрофорезу, була високоочищена. Процес очищення видаляє забруднюючі речовини, які б заважали ферментам, використовуваним при молекулярному клонуванні, таких як рестрикційні ендонуклеази. Процес також генерує препарат агарози з бажаними електрофоретичними властивостями і мінімальною фоновою флуоресценцією, що важливо для візуалізації молекул ДНК.

Молекули агарози здатні утворювати гелі з відносно визначеними розмірами пор через хімічні властивості молекул агарози.
Агароза демонструє гістерезис - температура її плавлення вище температури желирования. Молекули агарози розчиняються приблизно при 90° C, утворюючи випадкові котушки в розчині Гелі утворюються, коли температура падає приблизно до 40° C. коли гель утворюється, молекули агарози спочатку збираються в спіральні волокна, які потім додатково агрегуються, утворюючи мережі суперспіральних спіралей, стабілізованих водневими зв'язками. Розміри пір, які зазвичай коливаються від 50 до 200 нм, залежать від концентрації агарози. Зі збільшенням концентрації агарози середній діаметр пори зменшується.

Кілька факторів впливають на міграцію ДНК через агарозні гелі

Через негативного заряду залишків фосфату в магістралі ДНК молекули ДНК рухаються до позитивного полюса (анода) апарату електрофорезу. На фактичну швидкість міграції молекул ДНК в конкретному експерименті впливають численні фактори.
Деякі з цих факторів є притаманними молекулам ДНК, тоді як інші фактори стосуються електрофоретичних станів. До внутрішніх факторів належать як довжина, так і
конформація молекул ДНК, які аналізуються. У межах певного діапазону розмірів, продиктованого гелевими умовами, швидкість міграції лінійних молекул ДНК обернено пропорційна log10 (кількості пар основ). Міграція більш структурованих молекул ДНК, таких як суперспіральні плазміди, набагато менш передбачувана. На швидкість міграції цих більш високоструктурованих ДНК впливають щільність котушок, наявність гнізд та інші структурні особливості.

На швидкість міграції молекул ДНК в гелі агарози впливає також склад гелю. Швидкість міграції молекули ДНК зменшується в міру збільшення концентрації агарози в гелі. Дослідники зазвичай регулюють концентрацію агарози для оптимізації роздільної здатності молекул ДНК в межах певного діапазону розмірів. Два буфери, які зазвичай використовуються в лабораторіях, TAE (Тріс: ацетат: ЕДТА) та ТБЕ (Трис: борат: ЕДТА), також впливають на швидкість електрофорезу.

Через цю властиву мінливість дослідники ЗАВЖДИ включають смугу стандартів ДНК з відомими розмірами на тому ж гелі, що і аналізуються зразки. Важливо, що ці стандарти повинні мати подібну структуру (наприклад, лінійну або суперспіральну) і піддаватися тим самим хімічним модифікаціям, що і аналізуються зразки ДНК.

Флуоресцентні інтеркалятори використовуються для візуалізації молекул ДНК в гелі

Нуклеїнові кислоти візуалізуються флуоресцентними барвниками, які міцно зв'язуються з ДНК. Барвники являють собою інтеркаляційні агенти, які вставляються в спіраль ДНК і в структуровані ділянки одноланцюгових нуклеїнових кислот. Флуоресценція цих барвників збільшується на порядок, коли вони зв'язують нуклеїнові кислоти, тому фонова флуоресценція на агарозних гелів зазвичай низька. У цьому класі ми будемо використовувати бромід етидію (ETBr) для візуалізації фрагментів ДНК. ETBR поглинає світло в ультрафіолетовому (УФ) діапазоні і випромінює помаранчеве світло. Гелі проглядаються за допомогою спеціальних трансіллюмінаторів, що містять ультрафіолетові світильники. ETBR є світлочутливим з'єднанням, тому запаси зберігаються в темряві.

Стандарти використовуються для оцінки розмірів молекул ДНК

На малюнку праворуч показана смуга з ETBR-забарвленого 1% гелю агарози, що містить стандарти розміру ДНК. Сходи 1 кб, показані в цьому
студентському гелі, є власною сумішшю лінійних фрагментів ДНК розміром від 0,5 до 10 кілобаз (кб). Інтенсивність фарбування смуг на агарозних гелів відображає кількість ДНК в смузі, оскільки eTBR досить рівномірно інтеркалюється по довжині лінійних молекул ДНК. Як бачите, саме ця суміш містить аналогічні кількості кожного фрагмента ДНК, за винятком фрагмента 3 кб, який має на ~2,5 більше ДНК, ніж інші фрагменти. Більша інтенсивність фрагмента 3 кб служить корисним маркером орієнтації в ситуаціях, коли менші фрагменти могли стікати з кінця гелю або коли деякі маркери погано вирішуються один від одного. (Це загальні випадки!)

Зверніть увагу, що найкоротші молекули на гелі більш добре відокремлені один від одного, ніж більш довгі молекули. Продукти ПЛР, які ви будете аналізувати в цій лабораторії, в основному знаходяться в діапазоні 400-1000 bp. Для збільшення роздільної здатності цих молекул ми будемо використовувати 1,25% гелі агарози. (Це зменшить роздільну здатність більших молекул ДНК). Зверніть увагу також, що менші смуги здаються нечіткішими на вітражному гелі, оскільки вони більше постраждали від випадкової дифузії, оскільки вони мігрували через мережу агарозних полімерів.