11.7: Поліморфізми довжини фрагмента рестрикції

Last updated
Save as PDF

Page ID: 5849

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Рестрикційні ферменти розрізають ДНК в точних точках, виробляючи колекцію фрагментів ДНК точно певної довжини. Вони можуть бути розділені електрофорезом, при цьому менші фрагменти мігрують далі, ніж більші фрагменти. Один або кілька фрагментів можуть бути візуалізовані за допомогою «зонда» - молекули одноцепочечной ДНК, яка доповнює пробіг нуклеотидів в одному або декількох фрагментах рестрикції і є радіоактивною (або флуоресцентною). Якщо зонди стикаються з комплементарною послідовністю нуклеотидів у тестовому зразку ДНК, вони зв'язуються з нею шляхом сполучення бази Уотсона-Крика і таким чином ідентифікують її. Поліморфізми - це успадковані відмінності, виявлені серед особин у популяції.

Поліморфізми довжини рестрикційного фрагмента (RFLP) надали цінну інформацію в багатьох областях біології, включаючи скринінг ДНК людини на наявність потенційно шкідливих генів («Справа 1») та надання доказів для встановлення невинності або ймовірності вини підозрюваного в злочині ДНК» дактилоскопія» («Справа 3»).

Випадок 1: Скринінг на серповидно-клітинний ген

Серповидноклітинна хвороба - генетичне порушення, при якому обидва гени у пацієнта кодують амінокислоту валін (Val) в шостому положенні бета-ланцюга (бета ^S) молекули гемоглобіну. «Нормальні» бета-ланцюги (бета ^А) мають глутамінову кислоту в цьому положенні. Єдина відмінність між двома генами - заміна Т на А в середній позиції кодону 6. Це перетворює кодон GAG (для Glu) в кодон GTG для Val і скасовує послідовність (CTGAGG, яка охоплює кодони 5, 6 і 7), розпізнану і вирізану одним з ферментів рестрикції.

альт — Малюнок\(\PageIndex{1}\): Серповидно-клітинна мутація. Дані надані Антонаракісом С.Е.

Коли нормальний ген (бета ^А) перетравлюється ферментом і фрагментами, відокремленими електрофорезом, зонд зв'язується з коротким фрагментом (між червоними стрілками). Однак фермент не може розрізати серповидно-клітинний ген на цьому місці, тому зонд прикріплюється до набагато більшого фрагмента (між синіми стрілками).

\(\PageIndex{1}\)На малюнку показана родовід сім'ї, єдиний син якої хворіє серповидноклітинною хворобою. І його батько, і мати були гетерозиготними (напівзаповнена коробка та коло відповідно), оскільки вони повинні були виробляти страждану дитину (тверду коробку). Схеми електрофорезу для кожного члена сім'ї розміщуються безпосередньо під ними. Зауважте, що два гомозиготні діти (1 і 3) мають лише одну смугу, але вони більш інтенсивні, оскільки в них вдвічі більше ДНК. У цьому прикладі зміна одного нуклеотиду виробляє RFLP. Це дуже поширена причина RFLP, і зараз такі поліморфізми часто називають однонуклеотидними поліморфізмами або SNP. (Однак не всі RFLP виникають з SNP.

Як можна використовувати ці інструменти?

Випробувавши ДНК майбутніх батьків, можна визначити їх генотип і визначити їх шанси на отримання хворої дитини. У випадку серповидно-клітинної хвороби, якщо обидва батьки гетерозиготні для генів, існує ймовірність 1 з 4, що вони народять дитину з хворобою. Амніоцентез і забір ворсин хоріона дають можливість застосовувати ті ж методики до ДНК плода на ранніх термітах вагітності. Батьки можуть дізнатися, чи буде майбутня дитина вільний від хвороби чи ні. Вони можуть вибрати аборт, а не принести стражденну дитину у світ.

Три проблеми:

Мутації, які викликають більшість генетичних захворювань людини, більш різноманітні, ніж поодинокі мутації, пов'язані з серповидно-клітинною хворобою. Понад тисяча різних мутацій в гені муковісцидозу можуть викликати захворювання. Зонд для одного, ймовірно, не зможе визначити другий. Можна використовувати суміш зондів, по одному на кожну з найбільш поширених мутацій. Але залишається проблема «помилкових негативів»: люди, яким помилково кажуть, що вони не несуть мутантного гена.
Існує багато захворювань, які є наслідком декількох мутантних генів, які працюють разом, щоб виробляти фенотип захворювання.
Існують ще генетичні захворювання, для яких ще не виявлено жодного гена. Поки ген не може бути розташований, клонований та секвенований, жоден зонд не може бути зроблений для виявлення його безпосередньо. Однак іноді можна знайти генетичний «маркер», який може служити сурогатом для самого гена. Давайте подивимося, як.

Випадок 2: Скринінг на «маркер» RFLP

Якщо конкретний RFLP, як правило, пов'язаний з певним генетичним захворюванням, то наявність або відсутність цього RFLP може бути використаний для консультування людей про їх ризик розвитку або передачі захворювання. Припущення полягає в тому, що ген, який їх дійсно цікавить, розташований настільки близько до RFLP, що наявність RFLP може служити сурогатом для самого гена захворювання. Але люди, які бажають пройти тестування, не можуть просто зайти з вулиці. Через перетин, конкретний RFLP може бути пов'язаний з мутантним геном у деяких людей, зі здоровим алелем у інших. Таким чином, важливо обстежити не тільки пацієнта, але і якомога більше членів сім'ї пацієнта.

Найбільш корисні зонди для такого аналізу зв'язуються з унікальною послідовністю ДНК; тобто послідовністю, що відбувається тільки в одному місці генома. Часто ця ДНК має невідому, якщо така є, функція. Це насправді може бути корисним, оскільки ця ДНК була вільнішою для мутації без шкоди для власника. Зонд буде гібридизувати (зв'язуватися з) різної довжини перетравленої ДНК у різних людей залежно від того, де знаходяться місця різання ферментів, які кожна людина успадкувала. При цьому в популяції може бути присутнім велика різноманітність алелів (поліморфізмів). Деякі люди будуть гомозиготними і виявляють одну смугу; інші (наприклад, всі члени сім'ї, показані нижче) будуть гетерозиготними з кожним алелем, що виробляє свою смугу.

Родовід на малюнку\(\PageIndex{2}\) показує спадкування маркера RFLP через три покоління в одній родині. Всього в сімействі присутній 8 алелей (пронумерованих зліва від плям). RFLP кожного члена сім'ї розміщуються безпосередньо під його (квадратами) або її (колами) символом і номерами RFLP.

Якщо, наприклад, кожен, хто успадкував RFLP 2, також має певний спадковий розлад, і ніхто не бракує RFLP 2, не має розладу, ми виводимо, що ген захворювання тісно пов'язаний з цим RFLP. Якщо батьки вирішать завести іншу дитину, пренатальне тестування може виявити, чи була ця дитина схильна до захворювання. Але зверніть увагу, що перетин під час формування гамет міг перемістити RFLP на здоровий алель. Так що чим більше відстань між RFLP і локусом гена, тим нижче ймовірність точного діагнозу.

Випадок 3: ДНК «типування»

Кожна клітина людини містить 6 х 10 ⁹ пар основ ДНК. Деякі з них представляють гени, що кодують білок (наприклад, для бета-ланцюга гемоглобіну), які ідентичні значній частці людей. Але довгі ділянки ДНК ні для чого не кодують і вільні широко мутувати. Здається певним, що якби ми могли прочитати всю послідовність ДНК у кожної людини, ми ніколи не знайдемо двох однакових (якщо тільки зразки не були від однакових братів і сестер; тобто похідних від однієї зиготи).

Таким чином, ДНК кожної людини настільки ж унікальна, як відбиток пальця. Ця правда не уникла правоохоронних і юридичних професій. Аналіз ДНК, який називається типуванням ДНК, широко використовується для виявлення насильників та інших злочинців, визначення батьківства; тобто, ким насправді є батько дитини, визначити, чи є надійний іммігрант, як він стверджує, дійсно близьким родичем вже створених жителів.

Приклад\(\PageIndex{1}\): Rape Suspect

\(\PageIndex{3}\)На малюнку показані результати випробувань у справі про згвалтування. Було використано два зонда: один розкриває смуги вгорі, інший - внизу.

ДНК було перевірено з

сперма, видалена з піхви жертви згвалтування (ДОКАЗ #2);
пляма сперми, що залишилася на одязі потерпілого (ДОКАЗИ #1);
ДНК самої жертви (ЖЕРТВИ), щоб бути впевненим, що ДНК не надійшла з її клітин;
ДНК двох підозрюваних (ПІДОЗРЮВАНИЙ #1, ПІДОЗРЮВАНИЙ #2);
набір фрагментів ДНК відомої і зменшується довжини (MARKER). Вони забезпечують вбудовану лінійку для вимірювання точної відстані, яке проходить кожен фрагмент.
клітини попередньо перевіреної людини, щоб переконатися, що зонди працюють належним чином (КОНТРОЛЬ).

Однією з основ цього тесту, підозрюють #2 явно можна виключити. Жодна з його груп не відповідає групам, знайденим у спермі.

Чи винен підозрюваний #1?

Ми ніколи не можемо бути впевненими. Найкраще, що ми можемо зробити, це оцінити ймовірність того, що інша людина, вибрана випадковим чином, може надати той самий відбиток ДНК. За консервативною оцінкою, даний алель (смуга) може бути знайдений у 25% людей, які пройшли тестування. Імовірність випадкового збігу двох алелей становить (0,25) ² або 1 з 16. Імовірність того, що 6 алелей збігаються, як і в цьому випадку, становить (0,25) ⁶ або 1 в 4096. Однак підозрюваного вибрали не навмання, тому ви можете відчути, що докази провини є сильними.

Чим більше зондів ви використовуєте, тим впевненіше ви можете бути, що ви отримали потрібну людину. Якщо, наприклад, набір зондів виявив 14 смуг в ДНК підозрюваного, ідентичних тим, що у зразку сперми, ймовірність того, що у вас є неправильний чоловік, зменшується до менш ніж 1 з 268 мільйонів (0,25) ¹⁴ = 1/268 435 456, що майже так само велике, як і все населення, чоловіки та жінки, в Сполучених Штатах.

Починаючи з 1999 року, правоохоронні органи як у Великобританії, так і в США почали переходити на нову версію аналізу RFLP з використанням більш коротких послідовностей під назвою STR («Короткі тандемні повтори»). ЗПСШ - це повторювані послідовності декількох (зазвичай чотирьох) нуклеотидів, наприклад, TCATTCATTCATTCAT. Вони часто зустрічаються в неперекладених частинами відомих генів (послідовність яких може бути використана для ПЦР-праймерів). Точна кількість повторів (6, 7, 8, 9 і т.д.) різниться у різних людей (і, найчастіше, в гені на кожній хромосомі; тобто люди часто гетерозиготні для маркера).

Коли досліджуються 13 локусів STR, розкиданих по різних хромосомах, ймовірність того, що дві людини, вибрані навмання, мають однакову картину, становить менше 1 на 1 трильйон. Федеральне бюро розслідувань США (ФБР) хоче збільшити кількість досліджуваних локусів до 20, ще більше усунувши можливість помилкових спрацьовувань.