11.3: Генна терапія - методи та перспективи

Last updated
Save as PDF

Page ID: 5867

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Багато захворювань людини викликані дефектними генами. Кілька поширених прикладів наведені в таблиці\(\PageIndex{1}\); всі ці захворювання викликані дефектом в одному генному локусі. (Успадкування є рецесивним, тому і материнська, і батьківська копії гена повинні бути дефектними.) Чи є надія на впровадження функціональних генів у цих пацієнтів, щоб виправити їх розлад? Напевно. Інші захворювання також мають генетичну основу, але, схоже, кілька генів повинні діяти узгоджено, щоб виробляти фенотип захворювання. Перспективи генної терапії в цих випадках здаються набагато віддаленішими.

Таблиця\(\PageIndex{1}\): Хвороби людини, спричинені дефектним геном
Хвороба	генетичний дефект
гемофілія А	відсутність фактора згортання крові VIII
муковісцидоз	дефектний білок хлорид каналу
м'язова дистрофія	дефектний м'язовий білок (дистрофін)
серповидно-клітинна хвороба	дефектний бета-глобін
гемофілія В	відсутність фактора згортання IX
важкий комбінований імунодефіцит (SCID)	будь-який з декількох генів не в змозі зробити білок, необхідний для функції T і B клітин

Важкий комбінований імунодефіцит (SCID)

SCID - це захворювання, при якому пацієнт не має ні клітинних імунних реакцій, ні здатний виробляти антитіла. Це хвороба маленьких дітей, оскільки до недавнього часу відсутність імунної системи залишала їх здобиччю інфекцій, які в кінцевому підсумку вбивали їх. Близько 25% випадків SCID є результатом того, що дитина гомозиготна для дефектного гена, що кодує фермент аденозиндеаміназу (ADA). Нормальний катаболізм пуринів дефіцитний, і це особливо токсично для Т-клітин і В-клітин.

Варіанти лікування SCID включають:

Виховуйте дитину в суворо безмікробному середовищі: всю їжу, воду та повітря потрібно стерилізувати. Девід, «хлопчик міхура» з Х'юстона, пережив таким чином, поки йому не виповнилося 12 років.
Дайте дитині пересадку кісткового мозку від нормального, гістосумісного, донора. В ідеалі це дало б дитині безперервне джерело АДА ⁺ T і B клітин. Однак, незважаючи на те, що дитина не може відхилити трансплантацію (дитина не має імунної системи), Т-клітини в трансплантації (якщо донор не був ідентичним близнюком) можуть атакувати клітини дитини, що виробляє хворобу трансплантата проти господаря. Крім того, донорські клітини можуть бути заражені вірусом, який може перевантажити реципієнта до відновлення його імунної системи. (Девід отримав трансплантацію кісткового мозку від сестри, але вона, як і багато людей, раніше була заражена вірусом Епштейна-Барр (причина «моно»)). Вірус все ще був присутній в клітині, які вона пожертвувала, і вбив її брата.
Дають ін'єкції АДА (фермент в даний час видобувається з корів). При кон'югуванні з поліетиленгліколем (ПЕГ) для затримки його розпаду в крові ін'єкції ADA-PEG зберігали пацієнтів з SCID досить здоровими. Але так само, як і ін'єкції інсуліну діабетика, їх необхідно повторювати через часті проміжки часу. Отже,
Надання пацієнту функціонуючих генів АДА - генна терапія

Вимоги до генної терапії

Ген повинен бути ідентифікований і клонований. Це було зроблено для гена ADA. Його необхідно вставляти в клітини, які можуть займати тривале проживання у пацієнта. Поки що це означає видалення власних клітин пацієнта, лікування їх в культурі тканин, а потім повернення їх хворому. Його потрібно вставити в ДНК, щоб вона була виражена адекватно; тобто транскрибувати та переводити з достатньою ефективністю, щоб вироблялися гідні кількості ферменту. Всі ці вимоги, здається, були виконані для терапії SCID з використанням ретровірусу як генного вектора. Ретровіруси мають ряд переваг для впровадження генів в клітини людини.

альт — Малюнок\(\PageIndex{1}\): (ліворуч) вектор ADA та (праворуч) ретровірусний геном калічений

Їх оболонка білка дозволяє вірусу інфікувати клітини людини.
РНК-копії гена ADA людини можуть бути включені в ретровірусний геном за допомогою пакувальної клітини.

Пакувальні клітини обробляються таким чином, вони експресують РНК-копію гена ADA людини разом із сигналом упаковки (P), необхідним для складання свіжих вірусних частинок. Їм також потрібні інвертовані повтори (» R «) на кожному кінці, щоб допомогти вставці копій ДНК в ДНК клітини-мішені. Їм потрібна РНК копія ретровірусних генів gag, pol та env, але без сигналу упаковки (тому ці гени не можуть бути включені в свіжі вірусні частинки).

Оброблена цими двома геномами, пакувальна клітина виробляє урожай ретровірусів з:

білок оболонки, необхідний для інфікування клітини-мішені людини
РНК-копія гена ADA людини, в комплекті з R послідовностями на кожному кінці
зворотна транскриптаза, необхідна для створення копії ДНК гена ADA, яка може бути вставлена в ДНК клітини-мішені
жоден з генів (gag, pol, env), які дозволили б вірусу реплікуватися в своєму новому господареві.

Після того, як вірус заразив клітини-мішені, ця РНК зворотно транскрибується в ДНК і вставляється в хромосомну ДНК господаря.

Клітини-мішені: Т-клітини

Перші спроби генної терапії для дітей SCID (в 1990 році) використовували власні Т-клітини (вироблені після терапії ADA-PEG) в якості клітини-мішеней. Т-клітини були:

поміщається в культуру тканин
стимулюється до проліферації (шляхом лікування їх лімфокіну, інтерлейкіну 2 (ІЛ-2)
інфіковані ретровірусним переносником
повернувся, в серії процедур, до дитини

У дітей покращилася імунна функція, але ін'єкції довелося повторювати, оскільки Т-клітини живуть у крові лише 6—12 місяців. Більше того, діти також продовжували отримувати ADA-PEG, тому фактична користь від генної терапії була неясною.

Клітини-мішені: стовбурові клітини

Кров'яні («кровотворні») стовбурові клітини:

продукують (шляхом мітозу) всі види клітин крові, включаючи Т і В-лімфоцити
виробляють (шляхом мітозу) більше стовбурових клітин, забезпечуючи тим самим невичерпний запас

У червні 2002 року команда італійських та ізраїльських лікарів повідомила про двох молодих пацієнтів з SCID, які лікувалися власними стовбуровими клітинами крові, які були перетворені in vitro з ретровірусним вектором, що несе ген ADA. Через рік обидві діти мали повноцінно функціонуючу імунну систему (T, B та NK клітини) і змогли жити нормальним життям без необхідності лікування ADA-PEG або імунним глобуліном (IG). Лікарі пояснюють свій успіх першим знищенням деяких клітин кісткового мозку своїх пацієнтів, щоб «звільнити місце» для перетворених клітин. Дев'ять років потому (серпень 2011) ці два пацієнти все ще процвітають і до них приєдналися 28 інших успішно лікуваних дітей, більшість з яких більше не потрібно приймати ADA-PEG.

Генна терапія для X-зчеплених SCID

Генна терапія також досягла успіху для 20 хлопчиків, які страждали іншою формою важкого комбінованого імунодефіциту під назвою X-зв'язаний SCID, оскільки він викликаний мутованим Х-зв'язаним геном, кодуючим субодиницю - називається γc (гамма-c) - рецептора для декількох інтерлейкінів, в тому числі інтерлейкін-7 (ІЛ-7). IL-7 необхідний для перетворення стовбурових клітин крові в попередників Т-клітин. Хлопчики з X-зв'язаним SCID можуть робити нормальні В-клітини, але оскільки В-клітинам потрібні Т-хелперні клітини для функціонування, ці хлопчики не могли робити ні опосередкованих клітин, ні опосередкованих антитілами імунних реакцій і повинні були жити в стерильному бульбашці перед їх лікуванням.

Їхні лікарі

виділені стовбурові клітини крові з кісткового мозку кожної дитини
обробляли клітини ретровірусним вектором, що містить нормальний ген для субодиниці рецептора γc інтерлейкіну
повернули оброблені клітини кожному донору

Результати: Зараз, після 11 років, 19 з цих хлопчиків

здатні жити нормальним життям вдома, а не всередині стерильного «міхура»
мають нормальні (за деякими винятками *) номери Т-клітин як підмножин CD4, так і CD8
відреагували на кілька дитячих щеплень, включаючи дифтерію, правець та поліомієліт, виробляючи як Т-клітини, так і антитіла, специфічні для цих агентів
Вироблення антитіл досить хороша, що у більшості хлопчиків немає необхідності в періодичних вливаннях імунного глобуліну (ІГ)

У п'яти маленьких хлопчиків розвинувся лейкемія (один помер):

в одному випадку, викликаному проліферуючим клоном γδ Т-клітин, в якому вектор вставив себе в ген (на хромосомі 11), причетний до деяких випадків гострого лімфобластного лейкозу (ALL)
у другому випадку лейкемія була αβ Т-клітин

Генна терапія β-таласемії

β-таласемія є спадковим захворюванням. Найважчі випадки є наслідком мутацій в обох копіях гена, що кодує бета-ланцюг гемоглобіну. Було виявлено багато причинних мутацій, і більшість призводять до неможливості зробити будь-які бета-ланцюги. Отриманий гемоглобін погано функціонує і людині потрібні часті переливання крові. У 2010 році Каваццана-Кальво (і багато колег) повідомляють про єдиний випадок успішної генної терапії цього розладу; їх пацієнтом був 18-річний чоловік. Їх процедура передбачає збір стовбурових клітин крові у пацієнта та вплив на нього ретровірусного вектора, який містив

людський ген бета-гемоглобіну в комплекті з його промотором, енхансером та іншими контрольними елементами;
зміни вектора, щоб зробити його безпечним.
Після достатньої хіміотерапії, щоб «звільнити місце» для них, пацієнту вводили ці клітини.

Результат: Майже через три роки пацієнт добре і більше не вимагає періодичних переливань крові. Третина його гемоглобіну зараз виробляється червоноклітинними попередниками, що походять із змінених геном стовбурових клітин. Аналогічна процедура застосовувалася на кількох малюках, народжених з успадкованим захворюванням лізосомального зберігання або синдромом Віскотта-Олдріча (інший тип імунної недостатності). До двох років після лікування ретровірусним вектором, що містить інтактний ген, ці діти виявляли будь-які ознаки своїх розладів (повідомляється у випуску Science від 23 серпня 2013 року).

Вектори аденовірусу

Аденовіруси є хвороботворними мікроорганізмами людини, відповідальними за деякі випадки «застуди» людини. Модифіковані версії двох штамів в даний час використовуються як вектори у випробуваннях генної терапії. Переваги аденовірусу: На відміну від ретровірусних векторів, вони не інтегруються в геном господаря і, отже, не повинні бути в змозі порушити гени господаря (Це було таке порушення, яке спричинило деякі Х-зв'язані SCID пацієнтів, які лікувалися ретровірусним вектором, розвивати лейкемію), і вони можуть інфікувати неріділящіе клітини з високим ККД. Недоліки полягають у тому, що вони викликають потужну імунну відповідь, як Т-клітинами, так і В-клітинами (антитілами), тому повторні дози незабаром втрачають свою ефективність. Більш того, у багатьох людей вже є антитіла проти вірусу від ранніх «застуд», і вони можуть інактивувати вектор на самому початку. Недавнє випробування вакцини проти ВІЛ з використанням аденовірусу в якості вектора було зупинено, коли було виявлено, що вона не тільки не є ефективною, але і у людей з раніше існуючим високим рівнем антиаденовірусних антитіл, можливо, навіть підвищила їх сприйнятливість до ВІЛ.