Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

9.8: Хроматин Імуноопадів

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    5659

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Багато ДНК-зв'язуючі білки, такі як фактори транскрипції, зв'язуються зі специфічними послідовностями нуклеотидів в, наприклад, промоторах і підсилювачах генів. Деякі приклади:

    • генералізований еукаріотичний промотор
    • множинні фактори транскрипції, пов'язані з промотором Drosophila eve
    • глюкокортикоїдний рецептор (білок), пов'язаний з його елементом відповіді (ДНК)
    • репресор триптофану, пов'язаний з його оператором

    Зв'язування білка з ДНК здійснюється нековалентними силами і легко оборотне. Насправді, коли умови в клітині змінюються, відбувається динамічне надходження і відбувається ДНК-зв'язуючих білків по всьому геному. Ідентифікація конкретного ділянки в ДНК, пов'язаної певним білком в конкретний час, може бути виявлена за допомогою методики хроматинімунопреципітації (CHIP).

    Порядок дій

    1. Збирайте свою клітинну популяцію в потрібний час. Деякі приклади:
      • дріжджові клітини, що ростуть на певному нутрієнті
      • клітини HelA, що піддаються впливу певного цитокіну;
      • клітини слинних залоз дрозофіли в момент окукливания.
    2. Обробіть клітини формальдегідом (HCHO), який створює ковалентні зв'язки між білками та нуклеотидами, до яких вони були пов'язані нековалентно.
    3. Розбиваємо осередки, звільняючи їх вміст.
    4. Використовуйте ультразвук, щоб розбити ДНК на фрагменти довжиною близько 500 б.п.
    5. Додайте антитіло, яке специфічно зв'язується з цікавить вас білком.
    6. Додайте кульки, покриті протеїном А або протеїном S - обидва білки, які зв'язуються з будь-якими антитілами.
    7. Центрифугуйте комплекси бісера—антитіло-мішень-білок — ДНК.
    8. Нагрійте комплекси, щоб розірвати ковалентні зшивні зв'язки між білом-мішенню та ДНК.
    9. Перетравлюють білок протеазою, залишаючи очищені фрагменти ДНК.
    10. Провести ПЛР на фрагментах.
    11. Використовуйте будь-який з декількох методів для ідентифікації ампліфікованої ДНК, наприклад,
      • Південний блоттинг
      • Аналіз ДНК чіпа («чіп на чіпі»)
      • клон і послідовність («Чіп-SEQ»)