8.8: RII локус T4

Картування в гені: локус RII

Т2 і його близький родич Т4 - віруси, які заражають бактерію кишкової палички. Інфекція закінчується руйнуванням (лізису) бактеріальної клітини, тому ці віруси є прикладами бактеріофагів («пожирачів бактерій»). Вони були надзвичайно корисними в генетичних дослідженнях, оскільки:

• Віруси двох (і більше) різних генотипів можуть одночасно заражати одну бактерію.
• Молекули ДНК одного з інфекційних вірусів можуть рекомбінуватися з молекулами іншого, утворюючи рекомбінантні молекули.
• Величезна кількість вірусів, що виділяються від величезної кількості бактеріальних господарів, дозволяє виявити навіть рідкісні рекомбінаційні події.

Інша сторінка - Генетика бактеріофагів - описує, як T2 використовується для відображення порядку та відносного інтервалу генів на одній круговій молекулі ДНК, яка є геномом вірусу. Тут давайте подивимося, як T4 може бути використаний для виявлення мутацій в межах одного гена і прискорення процесу відображення цих точкових мутацій за допомогою делеційних мутантів.

Виявлення мутації в межах одного гена

У генетиці бактеріофагів ми досліджували мутацію гена, позначеного r, для «швидкого лізису». Виявилося, що насправді існують три різні генні локуси — Ri, RiI та RiII — мутації, в будь-якій з яких виробляється фенотип швидкого лізу. Але, крім того, в кожній з них було виявлено багато мутацій. Чи може вірус дикого типу утворитися рекомбінацією між мутаціями в межах одного гена? Сеймур Бензер вирішив це з'ясувати.

Як ми бачили в генетиці бактеріофагів, частота рекомбінації між різними генами низька (близько 10 ^-2). Можна було б очікувати, що частоти рекомбінації між мутаціями в одному гені будуть набагато нижчими (10 ^-4 або менше). На щастя, Бензер міг використати явище, щоб дозволити йому виявляти такі рідкісні події: мутанти RiI, а також дикий тип T4 можуть заразити та завершити свій життєвий цикл у штамі кишкової палички, позначеної B. Однак, в той час як мутанти RiI можуть заразити штам кишкової палички, позначеної K , вони не можуть завершити свій життєвий цикл в штамі K. дикого типу T4 може.

Процедура полягала в інфікуванні штаму В в рідкій культурі двома мутантами, що підлягають випробуванню (позначені тут як r _x і r _y). Після інкубації вони були висаджені на газоні:

• штам B - який підтримує зростання всіх вірусів, тим самим даючи загальну кількість звільнених вірусів.
• штам K — на якому можуть рости тільки віруси дикого типу.

Частота рекомбінації між будь-якою парою мутацій обчислюється як

\[\text{Recombination Frequency} = \dfrac{2 \times \text{number of wild-type plaques (strain K plaques)}}{\text{total number of plaques (on strain B)}}\]

Ви повинні подвоїти число, знайдене на штамі K, тому що ви бачите лише половину рекомбінантів - інша половина складається з подвійних мутантів. Використовуючи цю техніку, Бензер врешті-решт виявив близько 2000 різних мутацій в гені RiI. Частота рекомбінації між деякими парами з них була такою ж низькою, як 0,02.

• Геном Т4 має 160 000 пар основ ДНК, що розширюються понад ~ 1600 сантиморганів (см).
• Отже, 1 см 100 пар основи
• Так 0,02 см являє собою пару сусідніх нуклеотидів.
• З цих даних Бензер зробив висновок, що
  • найменша одиниця мутації і
  • найменша одиниця рекомбінації
  була єдиною базовою парою ДНК.

Іншими словами, ці мутації являють собою зміну однієї базової пари — ми називаємо ці точкові мутації. Рекомбінація між двома молекулами ДНК може відбуватися при будь-якій парі нуклеотидів.

Відображення точкових мутацій в гені

Відносний порядок та інтервал будь-яких двох точкових мутацій в одному гені, як RiI, можна зробити за допомогою процедури, описаної в генетиці бактеріофагів. Але з деякими 2000 різних мутацій для тестування процес був би надзвичайно трудомістким. (Навіть використовуючи процедуру, яку слід описати зараз, Бензер витратив на проект близько 10 років.) Бензер зміг прискорити процес відображення, скориставшись відкриттям, що деякі з його мутантів не мали точкових мутацій, а видалення замість цього. На відміну від властивостей вірусів T4 з точковими мутаціями, віруси T4 з делеціями в RiI не показали рекомбінації з іншими мутантами RiI або будь-якими іншими генами з цього приводу. Більше того, ці видалення ніколи не мутували назад.

Відображення вилучення

Видалення можуть бути зіставлені за тією ж процедурою, яка використовується для точкових мутацій. Просто схрестіть пари делеційних мутантів і подивіться, чи виробляють вони потомство, яке може рости на штамі кишкової палички К. Ось гіпотетичний приклад. Кожен з 6 штамів делеційних мутантів схрещуються між собою.

Таблиця 8.8.1:

Штами	1	2	3	4	5	6
1	0	0	+	0	0	0	1 і 3 не перекриваються
2		0	+	+	0	0	повинні зрушити 4 від 2
3			0	+	+	0	6 повинні простягатися під 3
4				0	+	+	правий кінець 4 повинен бути видалений з більш ніж 6
5					0	+	лівий кінець 6 не повинен перекривати 5, а повинен продовжувати перекривати 2. ∴ скоротити правий кінець 5
6						0

З результатів можна намалювати карту, яка відображає порядок і відносний розмір вилучень.

За допомогою такої карти видалення тепер можна швидко зіставити розташування точкових мутацій, коінфікуючи кожен з різних штамів видалення (тут 1—6) з мутантним штамом («x»).

Більше немає необхідності рахувати бляшки; просто подивіться, чи є зростання чи ні.

Коінфікувати за допомогою штаму	1	2	3	4	5	6
і мутант «х» Результати →	0	0	+	+	0	+

З цих результатів ми дізнаємося, що точкова мутація «х» розташована на ДНК Т4 в межах області, показаної вище синім кольором.

Доповнення

Як ми бачили вище, були виявлені мутанти швидкого лізису (r), які відображаються на трьох різних областях генома T4: Ri, RiI та RiII. Це означало, що ті, що знаходяться в різних регіонах, не були алелями одного гена і більше одного генного продукту брали участь у функції лізису. Навіть в межах одного «локусу», RiI, виявилося два різних ділянки ДНК, обидва з яких були необхідні неушкодженими для функції лізису. Це було виявлено тестом на доповнення, який використовував Бензер. У цьому тесті,

• Штам кишкової палички K (який мутанти RiI можуть заразити, але не завершити свій життєвий цикл) - зростаючий в рідкій культурі - був
• співіснували з двома різними мутантами RII (показані на малюнку як «1» і «2»).

Зауважимо, що дана процедура відрізняється від попередньої (рекомбінації) тим, що для початкової інфекції використовується непермісійна кишкова паличка К (не штам В, як раніше). Ні штам RiI «1», ні штам RiI «2» не здатний вирости в кишковій паличці К. Але якщо втрачена функція в RiI «1» НЕ така ж, як втрачена функція в RiI «2», то

• кожен повинен мати можливість виробляти генний продукт, відсутній в іншому - комплементація - і
• Будуть вироблятися живі фаги. (Знову ж таки, немає необхідності рахувати бляшки; просто подивіться, утворюються вони чи ні.)

штами мутантів	1	2	3	4	5
1	0	0	+	0	+
2		0	+	0	+
3			0	+	0
4				0	+
5					0

З цих результатів можна зробити висновок, що ці 5 мутантів RiI потрапляють на дві різні групи комплементації, які Бензер позначив A (що містить штами 1, 2 і 4) і B (що містять штами 3 і 5). Пізніші роботи показали, що функція RiI залежала від поліпептидних продуктів, кодованих двома суміжними областями (A і B) RiI (можливо, діючими як гетеродімер). З точки зору функції, то і A, і B кваліфікуються як незалежні гени. При коінфекціях двома мутантними штамами,

• Якщо на одній молекулі ДНК мутують або A, або B («cis»), функції поки немає
• якщо A мутується в одній молекулі ДНК і B в іншій («транс»), функція відновлюється.

Таким чином, комплементація - це здатність двох різних мутацій відновлювати функцію дикого типу, коли вони знаходяться в «транс» (на різних молекулах ДНК), але не тоді, коли вони знаходяться в «цисі» (на одній молекулі ДНК). Бензер придумав термін цистрон для цих генетичних одиниць функції. Але сьогодні ми просто модифікуємо більш ранні поняття «гена», щоб відповідати цьому оперативному визначенню.