6.2: Транскрипція ДНК в РНК

Більшість генів виражаються у вигляді білків, які вони кодують. Процес відбувається в два етапи:

• Транскрипція = ДНК → РНК
• Переклад = РНК → білок

Малюнок 6.2.1: Ось огляд центральної догми.

Генна транскрипція: ДНК → РНК

ДНК служить шаблоном для синтезу РНК так само, як і для власної реплікації.

Етапи транскрипції

• Деякі 50 різних факторів транскрипції білка зв'язуються з промоутерними сайтами, як правило, на 5′ стороні гена, який потрібно транскрибувати.
• Фермент, РНК-полімераза, зв'язується з комплексом транскрипційних факторів.
• Працюючи разом, вони відкривають подвійну спіраль ДНК.
• РНК-полімераза продовжує читати одну нитку, рухаючись у напрямку 3'→ 5'.
• У еукаріотів це вимагає - принаймні для генів, що кодують білок - щоб нуклеосоми перед прогресуючою РНК-полімеразою (Pol II) були видалені. За це відповідає комплекс білків. Цей же комплекс замінює нуклеосоми після транскрибування ДНК і Pol II рухався далі.
• Коли РНК-полімераза рухається по ланцюжку ДНК, вона збирає рибонуклеотиди (що постачаються у вигляді трифосфатів, наприклад, АТФ) у нитку РНК.
• Кожен рибонуклеотид вставляється в зростаючу пасмо РНК, дотримуючись правил парування основи. Таким чином, для кожного С, що зустрічається на нитку ДНК, в РНК вставляється G; для кожного G - C; і для кожного T, A A. Однак кожен А на ДНК направляє введення піримідину урацилу (U, з трифосфату уридину, UTP). У РНК немає Т.

.)

• Синтез РНК протікає в напрямку 5′ → 3′.
• Коли кожен нуклеозидний трифосфат вноситься, щоб додати до 3′ кінця зростаючої нитки, два кінцевих фосфати видаляються.
• Коли транскрипція завершена, стенограма звільняється від полімерази і незабаром після цього полімераза звільняється з ДНК.

Зверніть увагу, що в будь-якому місці молекули ДНК будь-яка нитка може служити шаблоном; тобто деякі гени «біжать» в одну сторону, деякі в іншу (і в декількох примітних випадках один і той же сегмент подвійної спіралі містить генетичну інформацію на обох нитках!). Однак у всіх випадках РНК-полімераза транскрибує ланцюг ДНК у напрямку 3'→ 5'.

Доповідь у випуску Nature від 4 січня 2001 року показує, що РНК-полімераза насправді відстежує навколо подвійної спіралі ДНК. In vitro, принаймні, коли РНК-полімераза іммобілізується, вона обертає молекулу ДНК навколо і навколо, коли вона рухається вздовж молекули. Чи це полімераза або ДНК, яка робить спінінг in vivo, ще належить визначити.

види РНК

Малюнок 6.2.1 Схема осідання РНК

Візерунок осідання виробляється шляхом високошвидкісного центрифугування РНК, витягнутої з попередників еритроцитів кролика. Дискретні смуги представляють конкретні класи РНК. Передача РНК діапазону приблизно на 4S. Рибосомні РНК осаду еукаріотів при 5S, 5.8S, 18S та 28S. (Чим більше одиниця осадження, S, тим більша молекула - але не пропорційно.) РНК, що утворює смугу при 9S, є месенджерною РНК для синтезу гемоглобіну, основного білка, синтезованого в цих клітині. У більшості типів клітин месенджерні РНК надзвичайно гетерогенні, з невеликими кількостями, розподіленими від 6S до 25S.

У ядрі еукаріотичних клітин синтезується кілька типів РНК.

• РНК месенджера (мРНК)
• рибосомальна РНК (рРНК)
• передача РНК (тРНК)
• мала ядерна РНК (sNRNA)
• мала ядерна РНК (SnРНК)
• мікроРНК (мiРНК). Це крихітні (~22 нуклеотиди) молекули РНК, які регулюють експресію молекул месенджерної РНК (мРНК).
• довга некодуюча РНК (lNcRNA)

РНК месенджера (мРНК)

Messenger РНК буде переведена в поліпептид. Messenger РНК поставляється в широкому діапазоні розмірів, що відображають розмір поліпептиду, який він кодує. Більшість клітин виробляють невелику кількість тисяч різних молекул мРНК, кожна з яких повинна бути перетворена в пептид, необхідний клітині. Багато мРНК є загальними для більшості клітин, кодуючи «домашні» білки, необхідні всім клітинам (наприклад, ферменти гліколізу). Інші мРНК специфічні лише для певних типів клітин. Вони кодують білки, необхідні для функції цієї конкретної клітини (наприклад, мРНК для гемоглобіну в попередниках еритроцитів).

Рибосомна РНК (рРНК)

Це буде використовуватися при побудові рибосом: машини для синтезу білків шляхом перекладу мРНК. Є 4 види. У еукаріотів це

• 18S рРНК. Одна з цих молекул, поряд з деякими 30 різними білковими молекулами, використовується для створення малої субодиниці рибосоми.
• 28S, 5.8S і 5S рРНК. По одній кожній з цих молекул разом з деякими 45 різними білками використовуються для створення великої субодиниці рибосоми.

Число S, задане кожному типу рРНК, відображає швидкість, з якою молекули осаджуються в ультрацентрифузі. Чим більше число, тим більше молекула (але не пропорційно). Молекули 28S, 18S і 5.8S виробляються шляхом обробки однієї первинної розшифровки з скупчення однакових копій одного гена. Молекули 5S виробляються з іншого скупчення однакових генів.

Перенесення РНК (тРНК)

Це молекули РНК, які переносять амінокислоти до зростаючого поліпептиду. У типовій еукаріотичній клітині існує близько 32 різних видів тРНК.

• Кожен є продуктом окремого гена.
• Вони невеликі (~4S), містять 73-93 нуклеотиди.
• Багато з основ в ланцюзі сполучаються між собою, утворюючи секції подвійної спіралі.
• Непарні області утворюють 3 петлі.
• Кожен вид тРНК несе (на своєму 3′ кінці) одну з 20 амінокислот (таким чином, більшість амінокислот мають більше однієї тРНК, відповідальної за них).
• На одній петлі 3 непарних підстави утворюють антикодон.
• Спарювання основи між антикодоном і комплементарним кодоном на молекулі мРНК приносить правильну амінокислоту у зростаючу поліпептидну ланцюг.

Мала ядерна РНК (SNRNA)

Транскрипція ДНК генів для мРНК, рРНК та тРНК виробляє великі молекули-попередники («первинні транскрипти»), які повинні бути оброблені всередині ядра для отримання функціональних молекул для експорту в цитозол. Деякі з цих етапів обробки опосередковані SNRNA.

Було ідентифіковано приблизно десяток різних генів для SNRNA, кожен з яких присутній у декількох примірниках. SNRNA відіграють різні ролі в обробці інших класів РНК. Наприклад, кілька SNRNA є частиною спліцеосом, які беруть участь у перетворенні пре-мРНК в мРНК шляхом висічення інтронів і сплайсингу екзонів.

Мала ядерна РНК (SnРНК)

Як випливає з назви, ці невеликі (60-300 нуклеотидів) РНК знаходяться в ядерці, де вони відповідають за кілька функцій:

• Деякі беруть участь у створенні рибосом, допомагаючи скоротити великий попередник РНК молекул 28S, 18S та 5.8S.
• Інші хімічно модифікують багато нуклеотидів у молекулах рРНК, тРНК та SnRNA, наприклад, додаючи метильні групи до рибози.
• Деякі були залучені до альтернативного зрощування попередньо мРНК до різних форм зрілої мРНК.
• Одна SnorNA служить шаблоном для синтезу теломерів.

У хребетних, SnorNA виготовляються з інтронів, видалених під час обробки РНК.

МікроРНК (мікроРНК)

МікроРНК» («miRNA») - це одноланцюгові молекули РНК, що містять близько 22 нуклеотидів і мають приблизно такий же розмір, як SirNA. МікроРНК містяться у всіх тварин (люди генерують близько 1000 мРНК) та рослин, але не у грибів. Вони містять 19-25 нуклеотидів. Вони є

• закодований в геномі
  • деякі за допомогою автономних генів (які можуть кодувати кілька mIRNA)
  • деякі порціями інтрона гена, мРНК якого вони будуть регулювати.
• може виражатися в
  • тільки певні типи клітин і
  • тільки в певний час при диференціації певного типу клітин.

Хоча прямі докази функції багатьох з цих нещодавно відкритих генних продуктів ще належить виявити, вони регулюють експресію генів, регулюючи месенджерну РНК (мРНК), або

• знищення мРНК, коли послідовності точно збігаються (звичайна ситуація у рослин) або
• пригнічення його перекладу, коли послідовності є лише частковим збігом.

МікроРНК мають дві риси, які ідеально підходять для цього:

• Будучи такими маленькими, їх можна швидко транскрибувати зі своїх генів.
• Їх не потрібно переводити в білковий продукт, щоб діяти.

МікроРНК регулюють (пригнічують) експресію генів у ссавців, а також. Аналіз геному виявив тисячі генів людини, стенограми яких (мРНК) містять послідовності, до яких може зв'язуватися один або кілька наших мікроНК. Ймовірно, кожна miRNA може зв'язуватися з цілими 200 різними мішенями мРНК, тоді як кожна мРНК має місця зв'язування для декількох мікроНК. Така система надає безліч можливостей для скоординованого перекладу мРНК.

Довга некодувальна РНК (lNcRNA)

Тільки месенджерна РНК кодує поліпептиди. Всі інші класи РНК, таким чином, називаються некодуючими РНК. Окрім РРНК, SNRNA та SNRNA, існує велика (понад 10 000 у людини) гетерогенна колекція стенограм, що перевищує 200 нуклеотидів, які класифікуються як ЛНКРНК. Функція, якщо така є, більшості з них залишається відкритою.

Однак було виявлено, що деякі LNCRNA беруть участь у регулюванні такої різноманітної діяльності, як сплайсинг, переклад, імпринтинг та транскрипція. Два приклади:

• XIST РНК, яка містить тисячі нуклеотидів, інактивує одну з двох Х-хромосом у жіночих хребетних.
• Деякі LNCRNA беруть участь у зближенні областей енхансера та промотора генів («зациклювання») для регулювання транскрипції генів.

Хоча багато ще належить дізнатися про їх функції, разом взяті некодуючі РНК, ймовірно, складають три чверті транскрипції, що відбувається в ядрі.

РНК-полімерази

РНК-полімерази - це величезні багатосубодиничні білкові комплекси. Три види зустрічаються у еукаріотів.

• РНК-полімераза I (Пол I). Він транскрибує гени рРНК для попередника молекул 28S, 18S та 5.8S (і є найбільш завантаженим з РНК-полімераз).
• РНК-полімераза II (Пол II; також відомий як RNAP II). Він транскрибує гени, що кодують білок, в мРНК (а також гени sNRNA).
• РНК-полімераза III (Пол III). Він транскрибує гени 5S рРНК і всі гени тРНК.

Обробка РНК: попередньо мРНК → мРНК

Всі первинні транскрипти, вироблені в ядрі, повинні пройти етапи обробки для отримання функціональних молекул РНК для експорту в цитозол. Ми обмежимося поглядом на кроки, які вони відбуваються при обробці пре-мРНК до мРНК.

Більшість еукаріотичних генів розщеплені на сегменти. При розшифровці відкритого кадру читання гена для відомого білка зазвичай стикаються періодичні розтяжки ДНК, що закликають до амінокислот, які не зустрічаються в фактичному білковому продукті цього гена. Такі розтяжки ДНК, які транскрибуються в РНК, але не переведені в білок, називаються інтронами. Ті ділянки ДНК, які роблять код для амінокислот в білку називаються екзонами. Приклади:

• Ген одного типу колагену, виявленого у курей, розщеплюється на 52 окремих екзонів.
• Ген дистрофіну, який мутується у хлопчиків з м'язовою дистрофією, має 79 екзонів.
• Навіть гени для рРНК і тРНК розщеплюються інтронами.
• Геном людини, за оцінками, містить близько 180 000 екзонів. При поточній оцінці в 21 000 генів середній вміст екзонів наших генів становить близько 9.

Малюнок 6.2.2 Обробка РНК

• Синтез капелюшка. Це модифікований гуанін (G), який прикріплений до 5′ кінця попередньої МРНК, коли він виходить з РНК-полімерази II (Пол II). Ковпачок
• захищає РНК від деградації ферментів, які погіршують РНК з 5-го кінця;
• служить точкою збірки білків, необхідних для набору малої субодиниці рибосоми, щоб почати трансляцію.

• Поетапне видалення інтронів, присутніх в пре-МРНК, і зрощування решти екзонів. Цей крок відбувається, оскільки попередня МРНК продовжує виходити з Пол II.
• Синтез полі (А) хвоста. Це розтяжка аденіну (А) нуклеотидів. Коли спеціальний полі (А) місце кріплення в попередньо МРНК виходить з Pol II, стенограма вирізається там, а полі (A) хвіст прикріплюється до відкритого кінця 3′. На цьому молекула мРНК, яка тепер готова до експорту в цитозол. (Решта стенограми деградується, а РНК-полімераза залишає ДНК.)

Малюнок 6.2.3 Гібридна молекула мРНК-

Вищевказане зображення являє собою електронну мікрофотографію гібридної молекули мРНК-ДНК, утвореної змішуванням месенджерної РНК (мРНК) з клону секретують антитіла клітин з одноцепочечной ДНК з того ж виду клітин. Брус являє собою довжину 1000 підстав. Нижня діаграма - це інтерпретація мікрофотографії. Суцільна лінія являє собою ДНК; пунктирною лінією - мРНК. Петлі (I _A, I _B і т.д.) представляють інтрони, які розділяють екзони, кодують домени важкого ланцюга антитіл:

• V = змінна область
• E ₁ = перша постійна область (C _H 1) домен
• E _H = область шарніра
• E ₂ і E ₃ = нуклеотиди, що кодують дві C-термінальні домени (C _H 2 і C _H 3)

Негібридизована частина мРНК - це її полі (А) хвіст.

Альтернативне зрощування

Обробка пре-МРНК для багатьох білків протікає різними шляхами в різних клітині або при різних умовах. Наприклад, на початку диференціації В-клітини (лімфоцита, який синтезує антитіло) клітина спочатку використовує екзон, який кодує трансмембранний домен, який змушує молекулу утримуватися на поверхні клітини. Пізніше В-клітина переходить на використання іншого екзона, домен якого дозволяє білку виділятися з клітини як молекула циркулюючого антитіла.

Альтернативне сплайсинг забезпечує механізм отримання найрізноманітніших білків з невеликої кількості генів. Хоча ми, люди, можливо, маємо лише близько 20 тисяч генів, ми, ймовірно, робимо щонайменше в 10 разів більшу кількість різних білків. Зараз підраховано, що 92— 94% наших генів виробляють попередньо МРНК, які альтернативно зрощуються. Є докази того, що схема альтернативного зрощування послідовно відрізняється в різних тканині і тому повинна регулюватися. Але чи всі продукти функціональні або що багато хто просто результат процесу, схильного до помилок, ще належить побачити.

Альтернативне сплайсинг забезпечує не тільки різні білки з одного гена, але й різні 3' UTRs і 5' UTRs. Хоча вони не перекладені на білок, вони в його перекладі або region s містять сигнали, які, наприклад, диктують, де в клітині буде накопичуватися білок. Два приклади:

• 3' UTR бікоїдного гена у дрозофіли направляє мРНК на передню частину ембріона
• ця ж область в гені VegT Xenopus направляє свою мРНК до вегетального полюса ембріона

Одним з найбільш драматичних прикладів альтернативного сплайсингу є ген Dscam в Drosophila. Цей єдиний ген містить близько 116 екзонів, з яких 17 зберігаються в кінцевій мРНК. Деякі екзони завжди включаються; інші вибираються з масиву. Теоретично ця система здатна виробляти 38 016 різних білків. І насправді в гемолімфі дрозофіли виявлено понад 18 000 різних.

Ці білки Dscam використовуються для встановлення унікальної ідентичності для кожного нейрона. Це працює так. Кожен розвивається нейрон синтезує десяток або близько того Dscam мРНК з тисяч можливостей. Які з них обрані, здається, просто справа випадковості, але через велику кількість можливостей, кожен нейрон, швидше за все, закінчиться унікальним набором з десятка або близько того Dscam білків. Оскільки кожен розвивається нейрон в центральній нервовій системі проростає дендрити і аксон, вони виражають свою унікальну колекцію білків Dscam. Якщо різні розширення одного нейрона повинні зустрічатися один з одним в заплутаній павутині, яка є відмінною рисою нервової тканини, вони відштовхуються. Таким чином, тисячі різних нейронів можуть співіснувати в інтимному контакті без небезпеки нефункціональних контактів між різними розширеннями одного і того ж нейрона.

нейрон повинен зіткнутися один з одним, вони уникають встановлення синапсу відштовхуванням, опосередкованим їх ідентичним колекцією протокадгеринів. Таким чином, тисячі різних нейронів можуть співіснувати в інтимному контакті без небезпеки нефункціональних контактів між різними розширеннями одного і того ж нейрона.

Чи буде певний сегмент РНК зберігатися як екзон або висічений як інтрон, може змінюватися за різних обставин, таких як

• в якому типі клітини знаходиться ген
• яку стадію диференціації проходить ця клітина
• які позаклітинні сигнали, які отримує клітина.

Зрозуміло, що перехід на альтернативний шлях зрощування повинен бути ретельно регламентований.

Транс-зрощування

Більшість генів транскрибуються, а їх стенограми обробляються, як описано вище. РНК-полімераза рухається по одній нитці одного генного локусу, утворюючи попередньо мРНК, яка обробляється (включаючи видалення інтронів) з утворенням зрілої мРНК. Але бувають і винятки. Було виявлено ряд випадків, коли дві різні транскрипти попередників були з'єднані разом, щоб сформувати кінцеву молекулу РНК. Явище називається транс-сплайсинг.

Приклади: синтез однієї молекули РНК шляхом зрощування разом транскриптів з локусів

• розташовані далеко один від одного на тій же хромосомі або
• на протилежних пасмах одного і того ж генного локусу або
• які є двома алелями гена на їх окремих (гомологічних) хромосомах.

Біологічне значення цих транс-зрощених стенограм досі невідома для більшості з них.