7.4: Ремонт ДНК
- Page ID
- 2517
Джерело: BiochemFFA_7_3.pdf. Весь підручник доступний безкоштовно від авторів за адресою http://biochem.science.oregonstate.edu/content/biochemistry-free-and-easy
Охорона генома
В останньому розділі ми розглянули способи, якими клітини справляються з проблемами, пов'язаними з реплікацією їх ДНК, життєво важливим процесом для всіх клітин. Очевидно, що якщо ДНК є майстерною копією інструкції для організму, то важливо не помилитися при копіюванні ДНК, щоб перейти на нові клітини. Хоча коректура ДНК-полімеразами значно підвищує точність реплікації, в клітині існують додаткові механізми для подальшого забезпечення того, що знову реплікована ДНК є вірною копією оригіналу, а також для відновлення пошкодження ДНК протягом нормального життя клітини.
Пошкодження ДНК
Вся ДНК зазнає пошкоджень з часом, від впливу ультрафіолету та іншого випромінювання, а також від різних хімічних речовин в навколишньому середовищі (рис. 7.34 & 7.35). Навіть хімічні реакції, що відбуваються в природі всередині клітин, можуть викликати сполуки, які можуть пошкодити ДНК. Як ви вже знаєте, навіть незначні зміни послідовності ДНК, такі як точкові мутації, іноді можуть мати далекосяжні наслідки. Так само невідновлені пошкодження, спричинені радіацією, хімічними речовинами навколишнього середовища або навіть звичайною клітинною хімією, можуть перешкоджати точній передачі інформації в ДНК. Підтримка цілісності «плану» клітини має життєво важливе значення, і це відображається в численних механізмах, які існують для виправлення помилок та пошкоджень ДНК.
Постреплікативний ремонт невідповідності
Раніше ми обговорювали коректуру ДНК-полімеразами при реплікації. У той час як коректура значно знижує частоту помилок, не всі помилки фіксуються на льоту ДНК-полімеразами.
Які існують механізми виправлення помилок реплікації, які пропускаються функцією коректури ДНК-полімераз? Помилки, які проскакують коректурою під час реплікації, можуть бути виправлені механізмом, який називається невідповідністю ремонту. Хоча частота помилок реплікації ДНК становить близько одного з 107 нуклеотидів за відсутності репарації невідповідності, це додатково зменшується в сто разів до одного з 109 нуклеотидів, коли відновлення невідповідності функціонально.
З якими завданнями стоїть невідповідність ремонтної системи?
Він повинен:
- Скануйте новоспечену ДНК, щоб побачити, чи є якісь помилкові основи (наприклад, G, парний до T)
- Визначте і видаліть область розбіжності.
- Правильно заповнити прогалину, створену висіченням області розбіжності.
розрізнення пасом
Важливо, що система ремонту невідповідності повинна мати засоби, щоб відрізнити новоспечену нитку ДНК від шаблонної нитки, якщо помилки реплікації повинні бути виправлені правильно. Іншими словами, коли система ремонту невідповідності стикається з помилкою A-G, наприклад, вона повинна знати, чи слід видалити та замінити A на C або якщо G слід видалити та замінити на T.
Але як система відновлення невідповідності відрізняє оригінальні та нові нитки ДНК? У бактерій існування системи, яка метилює ДНК в послідовностях ГАТК, є рішенням цієї проблеми. E.coli має фермент, ДНК-аденінметилазу (Dam), який додає метильні групи на аденини в послідовності ГАТК в ДНК (рис. 7.36). Нещодавно реплікована ДНК ще не пройшла метилювання і, таким чином, її можна відрізнити від шаблонної нитки, яка є метильованою.
Невідповідність протеїнів відновлення вибірково замінюють пасмо, що не вистачає метилювання, тим самим гарантуючи, що це помилки в щойно зробленої пасма, які видаляються і замінюються. Оскільки метилювання є критерієм, який дозволяє системі ремонту невідповідності вибрати пасмо, яка ремонтується, бактеріальна система відновлення невідповідності описується як метил-спрямована.
Рисунок 7.36- Метилаза Дам додає метильні групи в послідовності ГАТК
Невідповідність ремонтних генів
Репарація невідповідності добре вивчена у бактерій, а білки, що беруть участь, були виявлені. У E.coli невідповідність ремонтних білків кодуються групою генів, спільно відомих як гени муту. Важливими складовими невідповідності ремонтних машин є білки MuTs, MuTl і MuTh (рис. 7.37).
MUTs діє для визнання невідповідності, в той час як MutL і MutH набираються на сайт невідповідності шляхом прив'язки MUT. MutH - це ендонуклеаза, яка розрізає щойно синтезовану і, поки що, неметильовану нитку ДНК в GATC. Це активує геліказу ДНК та екзонуклеазу, які допомагають розкрутити та видалити область, що містить невідповідність. ДНК-полімераза III заповнює щілину, використовуючи протилежну пасмо в якості шаблону, і лігаза приєднується до кінців, щоб відновити суцільну пасмо.
Еукаріоти також мають невідповідність системи ремонту, яка ремонтує не тільки поодинокі невідповідності бази, але також вставки і видалення. Гомологи до кишкової палички MUT та mUTL були ідентифіковані в інших організмах, включаючи людей: HMSh1 і HMSh2 (гомолог MUT людини 1 і 2) гомологічні до MUT, тоді як HMLH 1 гомологічний MUTl. Вони разом з додатковими білками здійснюють репарацію невідповідності в клітинах-еукаріотів.
Метилювання ДНК не використовується еукаріотичними клітинами як спосіб відрізнити нову нитку від шаблону, і ще не до кінця зрозуміло, як система відновлення невідповідності у еукаріотів «знає», яку пасмо відновити. Є дані про те, що новоспечена ДНК може бути розпізнана за тим, що вона вирізана, або переривчаста. Це говорить про те, що розрив, отриманий в результаті фрагментів Окадзакі, які ще не були з'єднані між собою, може дозволити відрізнити нову пасмо від старої, безперервної шаблонної нитки.
Відновлення пошкоджень ДНК
У попередньому розділі ми розглянули помилки, допущені при копіюванні ДНК, куди при синтезі нової нитки вставляється неправильна основа. Але навіть ДНК, яка не реплікується, може пошкодитися або мутувати. Такі пошкодження не пов'язані з реплікацією ДНК, скоріше вони можуть виникнути в будь-який час.
Що спричиняє пошкодження ДНК?
Деякі основні причини пошкодження ДНК:
а. випромінювання (наприклад, ультрафіолетові промені на сонячному світлі та в кабінках для засмаги, або іонізуюче випромінювання)
b. вплив шкідливих хімічних речовин, таких як нітрозаміни або поліциклічні ароматичні вуглеводні, в навколишньому середовищі (див. Рис.
c Хімічні реакції всередині клітини (такі як дезамінація цитозину для отримання урацилу, або метилювання гуаніну для отримання метилгуаніна).
Це означає, що ДНК ваших клітин вразлива до пошкоджень просто від звичайних видів дій, таких як прогулянки на свіжому повітрі, перебування в пробці або від хімічних перетворень, що відбуваються в кожній клітині як частина її повсякденної діяльності. (Природно, шкода набагато гірша в ситуаціях, коли вплив радіації або шкідливих хімічних речовин більше, наприклад, коли люди регулярно користуються соляріями або курять.)
види пошкоджень
Яку шкоду завдають ці агенти? Випромінювання може викликати різного роду пошкодження ДНК.
Іноді, як і при більшій частині пошкоджень, завданих УФ-променями, дві сусідні піримідинові основи в ДНК будуть зшиті з утворенням циклобутанових піримідинових димерів або ДСП (див. Рис. Зверніть увагу, що це дві сусідні піримідинові основи на одній нитці ДНК. УФ-вплив також може призвести до утворення іншого типу ураження, відомого як (6-4) фотопродукт або 6-4PP (рис. 7.39). Іонізуюче випромінювання може викликати розриви в хребті ДНК, в одній або обох нитках.
Малюнок 7.39 - Можливі хімічні структури піримідинового димера - 6-4PP (зліва) і CPD (праворуч) - Вікіпедія
Молекули, такі як бензопірен, знайдені в автомобільних вихлопних газах, можуть прикріплюватися до основ, утворюючи об'ємні аддукти ДНК, в яких великі хімічні групи пов'язані з основами в ДНК. Пошкодження, такі як піримідинові димери, 6-4pps або хімічні аддукти, можуть фізично спотворити спіраль ДНК, викликаючи зупинку ДНК та РНК-полімерази, коли вони намагаються скопіювати ці ділянки ДНК (рис. 7.40).
Хімічні реакції, що відбуваються всередині клітин, можуть призвести до того, що цитозини в ДНК будуть дезінфіковані на урацил. Інші види пошкоджень цієї категорії включають утворення окислених основ, таких як 8-оксо-гуанін або алкільовані основи, такі як O6-метилгуанін. Вони насправді не змінюють фізичну структуру спіралі ДНК, але вони можуть спричинити проблеми, оскільки урацил та 8-оксо-гуанін пари з різними основами, ніж вихідний цитозин або гуанін, що призводить до мутацій на наступному раунді реплікації. O6-метилгуанін аналогічно може утворювати пари основи з тиміном замість цитозину.
Видалення пошкоджень
Клітини мають кілька способів видалення видів пошкоджень, описаних вище. Перший з них описується як прямий розворот. Багато організмів (хоча, на жаль для нас, не людей) можуть відновити пошкодження УФ-випромінюванням, як ДСП та 6-4PPS, оскільки вони мають ферменти, звані фотоліазами (фото = світло; ліаза = фермент розпаду - рис. 7.41). Фотоліази працюють через процес, який називається фотореактивацією, і використовують енергію синього світла для каталізації фотохімічної реакції, яка розриває аберрантні зв'язки в пошкодженій ДНК і повертає ДНК в початковий стан.
фермент самогубства
O6-метилгуанін в ДНК також може бути видалений шляхом прямого розвороту, за допомогою ферменту O6-метилгуанінметилтрансферази. Це дуже незвичайний фермент, який видаляє метильну групу з гуаніну і переносить її на залишок цистеїну в ферменті. Додавання метильної групи до цистеїну робить фермент нефункціональним.
Як відомо, більшість ферментів є каталізаторами, які залишаються незмінними протягом реакції, дозволяючи одній молекулі ферменту багаторазово каталізувати реакцію. Оскільки O6-метилгуанінметилтрансфераза не підходить під цей опис, її іноді не розглядають як справжній фермент. Його ще називають ферментом суїциду, тому що фермент «гине» в результаті власної діяльності.
Ремонт висічення
Ремонт висічення - ще одна поширена стратегія. Видалення - це загальний термін для вирізання та повторного синтезу пошкодженої ділянки ДНК. Існує кілька різних видів відновлення висічення, але всі вони передбачають висічення пошкодженої частини ДНК з подальшим відновленням синтезу, використовуючи іншу нитку як шаблон, і, нарешті, лігування для відновлення безперервності відновленої нитки. Клітини мають кілька різних видів видалення відновлення, кожен з яких спрямований на конкретні види пошкодження ДНК. Між ними ці ремонтні системи мають справу з найрізноманітнішими образами на геном.
Ремонт висічення нуклеотидів
Ремонт висічення нуклеотидів (NER) фіксує такі пошкодження, як утворення хімічних аддуктів, а також пошкодження УФ. Як хімічні аддукти, так і утворення ДСП або 6,4 фотопродуктів можуть викликати значне спотворення спіралі ДНК. Білки NER діють, щоб зрізати пошкоджену пасмо по обидва боки від вогнища ураження. Потім видаляється коротка частина ланцюга ДНК, що містить пошкодження, і ДНК-полімераза заповнює щілину відповідними нуклеотидами. Ремонт висічення нуклеотидів широко вивчався у бактерій.
При кишковій паличці розпізнавання і висічення пошкодження здійснюється групою білків, кодованих генами UvRaBC і UVRD. Білкові продукти генів uVRA, uVRB та uVRC функціонують разом як так звана ексцинуклеаза UvRaBC. Пошкодження спочатку розпізнається і зв'язується комплексом білків uVRa і UvRb. Після того, як комплекс зв'язується, uVRA дисоціює, залишаючи UvRb, прикріплений до ДНК, де до нього потім приєднується білок uVRC.
Стрижка пасма
Це комплекс, що складається з UvRb і C, який діє, щоб розрізати хребет фосфодіефіру по обидва боки пошкодження, створюючи уколи в пасмі приблизно 12-13 нуклеотидів один від одного. Helicase, закодована UvRd, потім розмотує область, що містить пошкодження, витісняючи її з подвійної спіралі разом з UvRbc. Проміжок в ДНК заповнюється ДНК-полімеразою, яка копіює неушкоджену пасмо, а нік запечатується за допомогою ДНК-лігази.
Ремонт висічення нуклеотидів також є важливим шляхом у еукаріотів. Це особливо важливо при видаленні УФ-ушкоджень у людини, враховуючи, що нам не вистачає фотоліаз. Виявлено ряд білків, які функціонують подібними до білків Uvr.
Важливість цих білків очевидна з того факту, що мутації в генах, які їх кодують, можуть призвести до ряду генетичних захворювань, таких як Xeroderma pigmentosum, або XP. Люди з XP надзвичайно чутливі до впливу ультрафіолету, оскільки пошкодження, спричинені ним, неможливо відновити, залишаючи їх набагато вищим ризиком розвитку раку шкіри.
Два режими ремонту
Ремонт висічення нуклеотидів працює у двох режимах, один відомий як глобальний геномний ремонт, а інший як ремонт, пов'язаний з транскрипцією. Хоча функція обох полягає у видаленні дестабілізуючих спіраль пошкоджень, таких як димери циклобутану піримідину або хімічні аддукти, спосіб виявлення уражень відрізняється.
При глобальному геномному ремонті пошкодження ідентифікуються шляхом спостереження за всім геном для спіральних спотворених уражень. У разі репарації, пов'язаної з транскрипцією, зупинка РНК-полімерази на місці пошкодження ДНК є показником, який активує цей режим відновлення висічення нуклеотидів.
Ремонт висічення бази
Репарація висічення бази (BER) - це механізм ремонту, який займається ситуаціями, такими як дезамінація цитозину до урацилу (рис. 7.43) або метилювання пуринової основи. Ці зміни, як правило, не спотворюють структуру спіралі ДНК, на відміну від хімічних аддуктів або пошкодження УФ.
При відновленні висічення основи спочатку видаляють одну пошкоджену основу з ДНК, а потім видаляють ділянку ДНК, що оточує відсутню основу. Потім зазор ремонтують.
Урацил-ДНК глікозилаза
Видалення урацилу з ДНК здійснюється ферментом Урацил-ДНК глікозилазою, яка може розпізнавати урацил в ДНК і розривати глікозидний зв'язок між урацилом і цукром в нуклеотиді (рис. 7.44). Видалення основи залишає щілину, звану апіримідинним ділянкою (ділянкою АП), оскільки в цьому випадку урацил, піримідин був видалений. Важливо пам'ятати, що в цей момент кістяк ДНК все ще залишається неушкодженим, а видалення єдиної основи просто створює щілину на зразок вибитого зуба.
Формування сайту AP запускає активність ферменту, відомого як ендонуклеаза AP, яка розрізає кістку ДНК 5' до місця AP. На інших етапах ДНК-полімераза зв'язується з ніком, потім, використовуючи свою екзонуклеазну і полімеразну активність, замінює послідовність в цій області. Залежно від ситуації може бути замінений один нуклеотид (короткий пластир BER) або видалити і замінити розтягнення з декількох нуклеотидів (довгий пластир BER). Нарешті, як завжди, ДНК-лігаза діє, щоб запечатати нік в ДНК.
Ремонт двожильних обривів
Хоча всі механізми ремонту обговорювалися до цих пір фіксували пошкодження на одній нитці ДНК, використовуючи іншу, неушкоджену нитку як шаблон, ці механізми не можуть відновити пошкодження обох ниток. Що буде, якщо пошкоджені обидві пасма? Іонізуюче випромінювання, вплив певних хімічних речовин або активні форми кисню, що утворюються в клітині, можуть призвести до дволанцюгових розривів (DSBs) в ДНК.
DSBs - це потенційно летальна форма пошкодження, яка, крім блокування реплікації та транскрипції, також може призвести до хромосомних транслокацій, де частина однієї хромосоми прикріплюється до шматочка іншої хромосоми. Існують два різних клітинних механізми, які допомагають відновити DSBs (рис. 7.45), гомологічну рекомбінацію (HR) та негомологічне з'єднання кінця (NHEJ).
Малюнок 7.45 - Негомологічне з'єднання кінця (ліворуч) проти гомологічної рекомбінації (праворуч) - Вікіпедія
Гомологічний рекомбінаційний ремонт зазвичай відбувається в пізніх фазах S і G2 клітини, коли кожна хромосома була реплікована і інформація від сестринського хроматида може бути використана як шаблон для досягнення безпомилкового відновлення. Зверніть увагу, що на відміну від відновлення висічення, де пошкоджена пасмо була видалена, а неушкоджена сестринська нитка служила шаблоном для заповнення пошкодженої області, HR повинен використовувати інформацію з іншої молекули ДНК, оскільки обидві нитки ДНК пошкоджені в DSBs.
Дія нуклеази
Виявлення двониткового розриву викликає нуклеазну активність, яка пережовує одну пасмо на кожному кінці розриву. Це призводить до виготовлення одножильних 3' свесів на кожному кінці. Ці однониткові кінці пов'язані декількома білками, створюючи нуклеопротеїнову нитку, яка потім може «шукати» гомологічні (відповідні) послідовності на сестринському хроматиді.
Коли такі послідовності виявляються, нуклеопротеїнова нитка вторгається в неушкоджений сестринський хроматид, утворюючи кросовер. Це створює гетеродуплекси, що складаються з ниток ДНК з різних хроматидів. Вторгнення ниток (рис. 7.47) супроводжується міграцією гілок, під час якої Холлідейський перехід рухається уздовж ДНК, розширюючи гетеродуплекс подалі від початкового місця кросовера (рис. 7.48). У кишкової палички міграція гілок залежить від активності двох білків, RuVA і RuVB. Отримана рекомбінація проміжна може бути вирішена, за допомогою RuVC надати повні, безпомилкові пасма.
Негомологічне торцеве з'єднання
На відміну від гомологічної рекомбінації, негомологічне з'єднання кінця (NHEJ) схильне до помилок. Він не використовує і не вимагає гомологічного шаблону для копіювання, і працює, просто пережовуючи зламані кінці DSBs і лігуючи їх разом. Не дивно, що NHEJ вводить видалення в ДНК в результаті.
Синтез ДНК
Як ми бачили, клітини мають різноманітні механізми, які допомагають захистити цілісність інформації в ДНК. Однією з мір останнього заходу є транслустраційний синтез ДНК, також відомий як синтез шунтування. Синтез транслюстрації відбувається, коли ДНК-полімераза стикається з пошкодженням ДНК на нитку шаблону, але замість того, щоб зупинятися або пропустити повз пошкодження, реплікація переходить на схильний до помилок режим, ігноруючи шаблон і включаючи випадкові нуклеотиди в нову нитку. У E.coli синтез транслумації залежить від активності білків, кодованих генами UMUC та UMud. За відповідних умов (див. Відповідь SOS нижче) UMuC та uMud активуються для початку синтезу обходу. Будучи схильним до помилок, синтез транслумації породжує багато мутацій.
Відповідь SOS
Названий для стандартних сигналів лиха SOS, термін «ремонт SOS» відноситься до клітинної реакції на пошкодження УФ. Коли бактеріальні клітини зазнають великих пошкоджень своєї ДНК в результаті УФ-впливу, вони включають узгоджену експресію великої кількості генів, необхідних для відновлення ДНК. До них відносяться гени uvr, необхідні для відновлення висічення нуклеотидів і ReCa, який бере участь у гомологічній рекомбінації. На додаток до цих механізмів, які можуть здійснювати безпомилкове відновлення, реакція SOS також може викликати експресію трансфораційних полімераз, кодованих генами DiNa, DinB та UmUcD.
Як всі ці гени координовано індукуються після ультрафіолетового пошкодження? Всі гени, індуковані у відповіді SOS, регулюються двома компонентами. Перший - це наявність короткої послідовності ДНК вище за течією області кодування, яка називається SOS box. Другий - це білок, репресор LexA (рис. 7.49), який зв'язується з коробкою SOS і запобігає транскрипції генів нижче за течією. Експресія генів вимагає видалення LEXa з місця його зв'язування. Як це досягається?
Коли вплив радіації призводить до розривів ДНК, наявність одноланцюгових областей запускає активацію і зв'язування білків ReCa з одноцепочечной областю, створюючи нуклеопротеїнову нитку. Взаємодія ReCa з репресором LexA призводить до ауторозщеплення репресора, що дозволяє експресувати ген (и) нижче за течією (рис. 7.50).
Гени, контрольовані репресором LexA, як уже згадувалося раніше, кодують білки, необхідні для точного відновлення ДНК, а також синтезу транслумації, схильного до помилок. Різні гени, що беруть участь у відновленні ДНК, індукуються в певному порядку. На початкових стадіях репараційні гени, які депресовані, призначені для відновлення висічення нуклеотидів з подальшою гомологічною рекомбінацією, як безпомилковими механізмами відновлення. Якщо пошкодження занадто великі, щоб бути відремонтовані цими системами, механізми ремонту, схильні до помилок, можуть бути введені в дію в крайньому випадку.
Відповідь SOS та стійкість до антибіотиків
Підвищена швидкість мутації у відповіді SOS може відігравати певну роль у придбанні стійкості до антибіотиків у бактерій (рис. 7.51).
Прикладом може служити розвиток резистентності до топоізомеразних отрут на кшталт препаратів сімейства фторхінолонів. Фторхінолони пригнічують здатність топоізомераз полегшувати кінці своїх субстратів після їх защемлення, щоб дозволити перемотаній ДНК розслабитися. Це призводить до накопичення розривів ниток, які можуть викликати реакцію SOS. Як наслідок схильного до помилок синтезу ДНК полімеразами низької вірності під час реакції SOS спостерігається велике збільшення кількості мутацій. Хоча деякі мутації можуть бути смертельними для бактерій, інші можуть сприяти швидкому розвитку лікарської стійкості у популяції.
