7.3: Реплікація ДНК

Джерело: BiochemFFA_7_2.pdf. Весь підручник доступний безкоштовно від авторів за адресою http://biochem.science.oregonstate.edu/content/biochemistry-free-and-easy

Копіювання інструкцій

Єдиний спосіб зробити нові клітини - це поділ вже існуючих клітин. Одноклітинні організми піддаються поділу, щоб виробляти більше клітин, як вони самі, тоді як багатоклітинні організми виникають через поділ однієї клітини, як правило, заплідненої яйцеклітини. Кожен раз, коли клітина ділиться, вся її ДНК повинна бути вірно скопійована, щоб копію цієї інформації можна було передати дочірній клітині. Цей процес називається реплікацією ДНК. Це засіб, за допомогою якого генетична інформація може передаватися поколінням клітин, і це гарантує, що кожна нова клітина має повну копію генома. У наступному розділі ми розглянемо процес, за допомогою якого повністю і точно копіюється ДНК клітини.

Малюнок 7.8 - Структура ДНК Уотсона і Крика - Вікіпедія

Структура ДНК, з'ясована Уотсоном і Криком в 1953 році, відразу запропонувала механізм, за допомогою якого дволанцюгова ДНК може бути скопійована, щоб дати дві однакові копії ДНК. Вони запропонували, щоб дві нитки молекули ДНК, які утримуються разом водневими зв'язками між базовими парними нуклеотидами, розділилися і кожен служив шаблоном, на якому може бути зібрана додаткова нитка (рис. 7.8). Правила сполучення основи гарантували б, що цей процес призведе до виробництва двох однакових молекул ДНК. Прекрасна простота цієї схеми була показана правильною в наступних експериментах Месельсона та Шталя, що продемонструвало, що реплікація ДНК була напівконсервативною, тобто, що після реплікації кожна з двох результуючих молекул ДНК складалася з однієї старої нитки та однієї нової нитки, яка була зібраний поперек від нього (рис. 7.9).

Малюнок 7.9 - Напівконсервативна реплікація - Зображення Марти Бейкер

Будівельні матеріали

Які інгредієнти необхідні для побудови нової молекули ДНК? Як зазначалося вище, в якості шаблону служить оригінальна, або батьківська молекула ДНК. Нові молекули ДНК збираються поперек від кожного шаблону шляхом об'єднання вільних нуклеотидів ДНК відповідно до правил сполучення основи, з As поперек від Ts і Gs через Cs.

Нуклеотиди, що використовуються в синтезі ДНК, - це дезоксирибонуклеозидні трифосфати або DNTP. Як можна зробити висновок з їх назви, такі нуклеотиди мають дезоксирибозний цукор і три фосфати, крім однієї з чотирьох основ ДНК, A, T, C або G (рис. 7.10).

Коли DNTP додаються до зростаючої ланцюга ДНК, два з цих фосфатів будуть відщеплені, як описано пізніше, залишаючи нуклеотиди в молекулі ДНК лише з одним фосфатом на нуклеотид. Ця реакція каталізується ферментами, відомими як ДНК-полімерази, які створюють фосфодіефірні зв'язки між одним нуклеотидом і наступним.

Малюнок 7.10 - Будівельні блоки ДНК

Виклики

Перш ніж досліджувати фактичний процес реплікації ДНК, корисно подумати про те, що потрібно для успішного виконання цього завдання. Розглянемо проблеми, з якими стикається клітина в цьому процесі:

• Величезна кількість нуклеотидів, які потрібно копіювати, величезна: наприклад, в клітині людини, порядку декількох мільярдів.
• Двоспіральна молекула батьківської ДНК повинна бути розмотана, щоб оголити окремі нитки ДНК, які можуть служити шаблонами для синтезу нових ниток ДНК.
• Розмотування повинно здійснюватися без введення топологічних спотворень в молекулу.
• Розмотані окремі нитки ДНК повинні бути збережені від повернення разом досить довго, щоб нові нитки були синтезовані.
• ДНК-полімерази не можуть почати синтез нової ланцюга ДНК de novo і вимагають вільного 3' ОН, до якого вони можуть додати дезоксинуклеотиди.
• ДНК-полімерази можуть розширювати нитку лише в напрямку від 5 до 3'. Зростання від 5 до 3' обох нових пасом означає, що одна з ниток зроблена шматками.
• Використання праймерів РНК вимагає, щоб нуклеотиди РНК повинні бути видалені і замінені нуклеотидами ДНК, а отримані фрагменти ДНК повинні бути з'єднані.
• Копіювання всієї батьківської ДНК повинно бути точним, щоб мутації не впроваджувалися в новоспечену ДНК.

Малюнок 7.11 - Реплікація ДНК - Вікіпедія

Малюнок 7.12 - Хромосоми людини

Малюнок 7.13 - Двонаправлена реплікація від походження - Марта Бейкер

Малюнок 7.14 - Реплікація прокаріотичної та еукаріотичної ДНК - Вікіпедія

Вирішення проблем

Маючи це на увазі, ми можемо почати вивчати, як клітини справляються з кожною з цих проблем. Наше розуміння процесу реплікації ДНК походить від досліджень з використанням бактерій, дріжджів та інших систем. Ці дослідження показали, що реплікація ДНК здійснюється під дією великої кількості білків, які діють разом як складна білкова машина. Були ідентифіковані та охарактеризовані численні білки, що беруть участь у реплікації, включаючи безліч різних ДНК-полімераз як у прокаріотів, так і у еукаріотів. Хоча конкретні білки, що беруть участь, різні у бактерій та еукаріотів, корисно зрозуміти основні міркування, які мають відношення до всіх клітин. Нижче представлений узагальнений звіт про етапи реплікації ДНК, орієнтований на проблеми, згадані вище.

• Величезна кількість нуклеотидів, які потрібно копіювати, величезна: наприклад, в клітині людини, порядку декількох мільярдів.

Клітини, будь то бактеріальні чи еукаріотичні, повинні повторити всю свою ДНК, перш ніж вони зможуть розділитися. У таких клітинок, як наша власна, величезна кількість ДНК розбивається на безліч хромосом, кожна з яких складається з лінійної нитки ДНК (рис. 7.12). У клітині, як у кишкової палички, є єдина кругова хромосома.

У будь-якій ситуації реплікація ДНК ініціюється на сайтах, які називаються витоками реплікації. Це ділянки молекули ДНК, які розпізнаються спеціальними білками, званими білками-ініціаторами, які зв'язують ДНК. У E.coli походження мають невеликі області A-T-багатих послідовностей, які «плавляться», щоб відокремити нитки, коли білки ініціатора зв'язуються з походженням або реплікацією. Як ви пам'ятаєте, пари основ A-T, які мають дві водневі зв'язки між ними, легше порушуються, ніж G-C база-пари, які мають три штуки (рис. 7.15).

Малюнок 7.15 - Пари основ A-T і G-C

Скільки витоків реплікації існує на хромосомі? У випадку з кишковою паличкою існує єдине походження реплікації на її круговій хромосомі. У клітині еукаріот може бути багато тисяч походження реплікації, причому кожна хромосома має сотні (рис. 7.16). Таким чином, реплікація ДНК ініціюється в декількох точках уздовж кожної хромосоми у еукаріотів. Електронні мікрофотографії реплікації ДНК з еукаріотичних клітин показують багато бульбашок реплікації на одній хромосомі. Це має сенс у світлі великої кількості ДНК, яку потрібно скопіювати в клітині, як наша власна, де початок з одного кінця кожної хромосоми і реплікація аж до іншого кінця від одного походження просто займе занадто багато часу. Це при тому, що ДНК-полімерази в клітині людини здатні будувати нові нитки ДНК з дуже респектабельною швидкістю близько 50 нуклеотидів в секунду!

• Подвійну спіральну батьківську молекулу необхідно розмотати, щоб оголити окремі нитки ДНК, які можуть служити шаблонами для синтезу нових ниток ДНК.

Розмотування

Після того, як невелика область ДНК відкривається на кожному походженні реплікації, спіраль ДНК повинна бути розмотана, щоб дозволити реплікації продовжити. Розмотування спіралі ДНК вимагає дії ферменту під назвою helicase.

Малюнок 7.16 - Бульбашка множинної реплікації на еукаріотичної хромосомі - Зображення Марти Бейкер

Малюнок 7.17 - Вид вилки реплікації еукаріотичної ДНК з геліказою, показаною синім кольором - Вікіпедія

Helicase використовує енергію, що виділяється при гідролізі АТФ, для розриву водневих зв'язків між основами в ДНК і відокремлення двох ниток (рис. 7.17). Зверніть увагу, що міхур реплікації складається з двох вилок реплікації, які «рухаються» або відкриваються в протилежних напрямках. На кожній виделці реплікації батьківські нитки ДНК повинні бути розмотані, щоб виставити нові ділянки одножильного шаблону.

• Це розмотування повинно здійснюватися без введення топологічних спотворень в молекулу.

Який ефект від розмотування однієї області подвійної спіралі? Локальне розмотування подвійної спіралі викликає перемотування (збільшення позитивного перекручування) попереду розмотаної області.

ДНК перед виделкою реплікації повинна обертатися, інакше вона закрутиться на собі і припинить реплікацію. Це головна проблема не тільки для кругових бактеріальних хромосом, але і для лінійних еукаріотичних хромосом, які, в принципі, могли обертатися, щоб зняти стрес, викликаний підвищеним суперкотуванням.

топоізомерази

Причина цього проблематична в тому, що неможливо обертати всю довжину хромосоми, з її мільйонами пар основ, оскільки ДНК на вилці реплікації розмотується. Як же тоді вирішується ця проблема? Ферменти, звані топоізомеразами, можуть зняти топологічне напруження, викликане місцевим «розмотуванням» зайвих вітрів подвійної спіралі. Вони роблять це, вирізаючи одну або обидві нитки ДНК і дозволяючи пасмам обертатися навколо один одного, щоб звільнити напругу перед повторним з'єднанням кінців. У кишкової палички топоізомераза, яка виконує цю функцію, називається гіразою.

• Відокремлені окремі нитки ДНК повинні бути збережені від повернення разом, щоб нові нитки були синтезовані.

Однонитковий ДНК зв'язуючий білок

Після того, як дві нитки молекули батьківської ДНК відокремлені, їм потрібно запобігти поверненню разом, щоб сформувати дволанцюгову ДНК. Для того щоб розмотані ділянки батьківської ДНК залишалися однонитковими і доступними для копіювання, відокремлені нитки батьківської ДНК пов'язані багатьма молекулами білка, званого однонитковим ДНК зв'язуючим білком (SSB - рис. 7.18).

Малюнок 7.18 - Білки на вилці реплікації прокаріотичної ДНК - Зображення Марти Бейкер

• ДНК-полімерази не можуть почати синтез нової ланцюга ДНК de novo і вимагають вільного 3' ОН, до якого вони можуть додати нуклеотиди ДНК.

Хоча однониткові батьківські ДНК тепер доступні для копіювання, ДНК-полімерази не можуть почати синтез комплементарної нитки de novo. Це просто означає, що ДНК-полімерази можуть додавати нові нуклеотиди лише на 3-футовий кінець вже існуючого ланцюга і не можуть самостійно розпочати ланцюжок нуклеотидів. Через це обмеження деякий фермент, крім ДНК-полімерази, повинен спочатку зробити невелику ділянку нуклеїнової кислоти, що доповнює батьківську нитку, яка може забезпечити вільний 3' ОН, до якого ДНК-полімераза може додати дезоксирибонуклеотид. Це завдання виконується ферментом під назвою примаза, який збирає короткий відрізок бази РНК, парний до батьківського шаблону ДНК. Це забезпечує коротку базову парну область, звану праймером РНК, з вільною групою 3'OH, до якої ДНК-полімераза може додати перший новий нуклеотид ДНК (рис. 7.12).

Розсувний затискач

Після того, як праймер надає безкоштовний 3'OH для розширення, інші білки потрапляють в акт. Ці білки беруть участь у завантаженні ДНК-полімерази на загрунтований шаблон і збереженні її пов'язаної з ДНК. Першим з них є затискний навантажувач. Як випливає з назви, навантажувач затискачів допомагає завантажувати білковий комплекс, який називається ковзаючим затискачем, на ДНК на вилці реплікації (рис. 7.19 і 7.20). Зсувний затискач, багатосубодиничний кільцеподібний білок, потім з'єднується ДНК-полімеразою. Функція ковзаючого затиску полягає в тому, щоб утримувати полімеразу, пов'язану з вилкою реплікації - насправді вона була описана як ремінь безпеки для ДНК-полімерази. Зсувний затискач гарантує, що ДНК-полімераза здатна синтезувати довгі ділянки нової ДНК, перш ніж вона дисоціює від шаблону. Властивість залишатися пов'язаним з шаблоном протягом тривалого часу перед дисоціацією відома як технологічність ферменту. При наявності ковзного затиску ДНК-полімерази набагато більш технологічні, що робить реплікацію швидшою та ефективнішою.

Малюнок 7.19 - Вид зверху ковзаючого затиску (зовні), що оточує нитку ДНК (всередині)

Малюнок 7.20 - Вид збоку ковзаючого затиску, що оточує нитку ДНК (фіолетовим кольором)

подовження грунтовки

ДНК-полімераза тепер готова почати синтез нової ланцюга ДНК (в E. coli первинна реплікативна полімераза називається ДНК-полімеразою III). Як ви вже знаєте, синтез нової ДНК здійснюється шляхом додавання нових нуклеотидів, що доповнюють ті, що знаходяться на батьківській нитці. ДНК-полімераза каталізує реакцію, за допомогою якої вхідний дезоксирибонуклеотид, доповнюючий шаблон, додається на 3' кінець попереднього нуклеотиду, починаючи з 3'OH на кінці праймера РНК. Важливість групи 3'OH полягає в характері реакції, яка будує ланцюжок нуклеотидів.

Реакція, каталізована ДНК-полімеразою, відбувається через нуклеофільну атаку групою 3'ОН в кінці нитка нуклеїнової кислоти на α фосфат вхідного dNTP (рис. 7.21). Негайний гідроліз пірофосфату, який відщеплюється від вхідного dNTp, рухає реакцію вперед. Послідовне додавання нових нуклеотидів на 3' кінці зростаючого ланцюга ДНК пояснює той факт, що нитка росте в напрямку від 5 до 3'.

Малюнок 7.21 - Механізм зростання ланцюга ДНК - Вікіпедія

5' фосфат на кожному вхідному нуклеотиді приєднується ДНК-полімеразою до 3' ОН на кінці зростаючого ланцюга нуклеїнових кислот, щоб зробити фосфодіефірний зв'язок. Кожен доданий нуклеотид забезпечує новий 3'OH, що дозволяє продовжити ланцюг до тих пір, поки ДНК-полімераза продовжує синтезувати нову нитку. Як ми вже відзначали, нові нитки ДНК синтезуються шляхом додавання нуклеотидів ДНК до кінця праймера РНК. Таким чином, нова молекула ДНК має короткий шматок РНК на початку.

• ДНК-полімерази можуть розширювати нитку лише в напрямку від 5 до 3'. Зростання від 5 до 3' обох нових пасом означає, що одна з ниток зроблена шматками.

провідна пасмо

Ми знаємо, що ДНК-полімерази можуть побудувати нову нитку ДНК лише у напрямку від 5 до 3 '. Ми також знаємо, що дві батьківські нитки ДНК є антипаралельними. Це означає, що на кожній вилці реплікації одна нова нитка, яка називається провідною ниткою, може бути синтезована безперервно в 5' до 3' напрямку, тому що вона робиться в тому ж напрямку, що і реплікації вилка відкривається вгору.

Відстаюча пасмо

Синтез іншої нової пасма, званої відстаючим пасмом, також протікає в напрямку 5' до 3'. Але оскільки шаблонні пасма йдуть в протилежні сторони, відстає пасмо подовжують в напрямку, протилежному отвору вилки реплікації (рис. 7.22). У міру відкриття вилки реплікації область позаду вихідної початкової точки для відстаючої пасма потрібно буде скопіювати. Це означає, що інший РНК грунтовка повинна бути покладена і розширена. Цей процес повторюється, коли відкривається вилка реплікації, з кількома праймерами РНК, укладеними та розширеними, утворюючи багато коротких шматків, які згодом з'єднуються. Ці короткі шматки нуклеїнової кислоти, кожен з яких складається з невеликої ділянки праймера РНК і близько 1000-2000 нуклеотидів ДНК, називаються фрагментами Окадзакі, для Рейдзі Окадзакі, вченого, який вперше продемонстрував своє існування.

Малюнок 7.22 - Двонаправлена реплікація ДНК за допомогою шаблонної нитки (а), провідною ниткою (b), фрагментами Окадзакі (c), виделкою реплікації (d), праймером РНК (e) та розширеними праймерами ДНК (f) - Вікіпедія

Малюнок 7.23 - Видалення праймерів РНК і з'єднання фрагментів Окадзакі - Вікіпедія

• Використання праймерів РНК вимагає, щоб нуклеотиди РНК повинні бути видалені і замінені нуклеотидами ДНК.

Видалення грунтовки

Ми бачили, що кожен нещодавно синтезований шматок ДНК починається з праймера РНК, ефективно роблячи нову нитку нуклеїнової кислоти, яка є частиною РНК і частиною ДНК. До новоствореної нитки ДНК не можна допускати приєднання шматочків РНК. Отже, нуклеотиди РНК повинні бути видалені, а проміжки заповнені нуклеотидами ДНК (рис. 7.23). Це робиться ДНК-полімеразою I в кишковій паличці. Цей фермент починає додавати нуклеотиди ДНК в кінці кожного фрагмента Окадзакі. Однак кінець одного фрагмента Окадзакі примикає до грунтовки РНК на початку наступного фрагмента Окадзакі. ДНК-полімераза I має екзонуклеазну активність, що діє в напрямку 5' до 3', що видаляє нуклеотиди РНК попереду неї, тоді як активність полімерази замінює нуклеотиди РНК з DNTP. Після того, як всі нуклеотиди РНК були видалені, відстаюча пасмо складається з розтяжок ДНК. Потім шматки ДНК з'єднуються між собою ферментом ДНК лігази.

Вищеописані кроки по суті завершують процес реплікації ДНК. Але одне питання все одно залишається.

• Забезпечення точності при копіюванні такої кількості інформації

Точність

Наскільки точним є копіювання інформації ДНК-полімеразою? Як ви знаєте, зміни послідовності ДНК (мутації) можуть змінити амінокислотну послідовність закодованих білків і що це часто, хоча і не завжди, шкідливо для функціонування організму. Коли мільярди основ ДНК копіюються під час реплікації, як клітини гарантують, що щойно синтезована ДНК є вірною копією вихідної інформації?

ДНК-полімерази, як ми вже зазначали раніше, працюють швидко (в середньому 50 основ в секунду в клітині людини і до 200 разів швидше в кишковій паличці). Тим не менш, як людські, так і бактеріальні клітини, здається, відтворюють свою ДНК досить точно. Це пов'язано з тим, що реплікативні ДНК-полімерази мають функцію коректури, яка дозволяє полімеразі виявляти, коли неправильне підставу було вставлено поперек від шаблонної нитки, резервне копіювання та видалення помилково вставленої основи, перш ніж продовжувати синтез (рис. 7.24).

Малюнок 7.24 - Помилка виправлена ДНК-полімеразами

Кілька видів діяльності

Це можливо тому, що більшість ДНК-полімераз є ферментами подвійної функції. Вони можуть розширити ланцюг ДНК завдяки своїй активності полімерази від 5 до 3'. Деякі полімерази, такі як ДНК-полімераза I, також можуть видалити праймери РНК у напрямку від 5 до 3', хоча це не є звичайною активністю полімераз. Однак багато полімераз мають можливість відслідковувати та видаляти останню вставлену основу, оскільки вони мають активність екзонуклеази від 3 до 5'.

Екзонуклеазна активність ДНК-полімерази дозволяє їй висікати неправильно вставлену основу, після чого полімеразна активність вставляє правильну основу і переходить до подовження пасма.

Іншими словами, ДНК-полімераза відстежує власну точність (також називається її вірністю), оскільки вона робить нову ДНК, виправляючи помилки безпосередньо перед тим, як перейти до додавання наступної бази. Цей механізм, який діє під час реплікації ДНК, виправляє багато помилок у міру їх виникнення, зменшуючи приблизно в 100 разів помилки, допущені при копіюванні ДНК.

ДНК-полімерази

Як зазначалося раніше, як прокаріотичні, так і еукаріотичні клітини мають множинні ДНК-полімерази. Наприклад, в E.coli ДНК-полімераза III є основною реплікативною полімеразою (вона ж репліказа), тоді як ДНК-полімераза I відповідає за відновлення ДНК, а також видалення праймераз РНК та їх заміщення нуклеотидами ДНК під час реплікації. ДНК-полімераза II відіграє певну роль у відновленні реплікації після пошкодження ДНК зупиняє реплікацію, тоді як ДНК-полімерази IV і V необхідні для транс-поразки або шунтування синтезу, що дозволяє реплікувати минулі ділянки пошкодження ДНК.

еукаріотичні полімерази

У еукаріотів налічується понад п'ятнадцять різних ДНК-полімераз. Первинні реплікативні полімерази в ядрі - і ε. ДНК-полімераза α також важлива для реплікації, оскільки вона має примазу та ремонтну діяльність. Реплікація ініціюється в еукаріотичних клітині ДНК-полімеразою α, яка зв'язується з комплексом ініціації на початку і закладає праймер РНК, а потім близько 25 нуклеотидів ДНК. Потім він замінюється іншою полімеразою, на етапі, який називається перемикач pol. ДНК-полімераза або ε потім продовжує синтезувати ДНК, в залежності від нитка. Роль полімерази ε, як видається, полягає в синтезі провідної нитки завдяки її високій технологічності та точності, тоді як полімераза поширює фрагменти Окадзакі на відстаючих пасмах. Також присутні білки, аналогічні навантажувача затиску і ковзаючого затиску. Білок RFC грає роль затискача навантажувача, тоді як інший білок, PCNA діє як ковзаючий затискач. Кілька інших ДНК-полімераз, таких як β, γ та μ, функціонують у відновленні прогалин. Проте інші беруть участь у транс-поразковому синтезі після пошкодження ДНК і пов'язані з гіпермутацією.

Незважаючи на свою різноманітність, ДНК-полімерази мають деякі загальні структурні особливості. Рентгенівські кристалографічні дослідження показали, що ці ферменти мають структуру, яку порівнювали з правою рукою людини (рис. 7.25 & 7.26). «Долоня» руки утворює ущелину, в якій лежить ДНК. Ущелина - це також місце, де знаходиться каталітична активність полімерази. Тут надходить нуклеотид додається до зростаючого ланцюга. «Пальці» розташовують ДНК в активній ділянці, тоді як «великий палець» утримує ДНК, коли вона виходить з полімерази. Окремий домен містить екзонуклеазну (коректорську) активність ферменту.

Фермент чергує свою полімеризуючу активність та коректорську активність. Коли невідповідна базова пара знаходиться в полімеразному каталітичному місці, 3'кінець зростаючої пасма переміщається з ділянки полімерази на активну ділянку екзонуклеази (рис. 7.26). Неправильна пара в кінці видаляється екзонуклеазою з подальшим переміщенням 3' кінця в активному місці полімерази для продовження синтезу.

Рисунок 7.25 ДНК-полімераза I зі структурою руки

Малюнок 7.26 - Коректура ДНК-полімеразою - Зображення Пера Якобсона

Малюнок 7.27 - ДНК-полімерази ссавців

Припинення реплікації

У кругових бактеріальних хромосомах існують специфічні послідовності, відомі як термінатори або сайти Тер. Це кілька коротких послідовностей, які служать ділянками припинення, дозволяючи вилам реплікації, що рухаються за годинниковою стрілкою та проти годинникової стрілки по круговій хромосомі, зустрічатися на одному з ділянок.

Зв'язування білка, Таким чином, на місці Тер запобігає подальшому руху вилки реплікації і закінчується реплікації. Батьківська та новоспечена кругова ДНК на цьому етапі топологічно взаємопов'язані і повинні бути відокремлені за допомогою топоізомерази.

Проблема кінцевої реплікації

Немає фіксованого місця для припинення в лінійних еукаріотичних хромосомах. У міру того, як вилки реплікації досягають кінців хромосоми, провідну пасмо можна синтезувати аж до кінця шаблонної пасма. На відстаючої пасма необхідність праймера РНК для початку синтезу створює виклик. Коли праймер РНК на крайньому кінці відстаючої пасма видаляється, відбувається невелика розтяжка шаблонної пасма, яку неможливо скопіювати. В результаті в кожному раунді реплікації буде втрачена коротка послідовність на кінцях хромосоми. Згодом, при багатьох циклах реплікації, хромосоми стали б помітно коротше. Це вкорочення хромосом спостерігалося in vitro, в культивованих соматичних клітині ссавців. Він також спостерігається в неушкоджених організмах, зі збільшенням віку.

Теломери

Який вплив робить втрата послідовності з кінців хромосом на клітини? Ми знаємо, що кінці хромосом характеризуються структурами, званими теломерами (рис. 7.28). Теломери складаються з багатьох копій коротких повторюваних послідовностей (у людей повторення - TTAGGG) та спеціальних білків, які спеціально зв'язуються з цими послідовностями. Ця структура теломерів корисна для відрізнення кінців хромосом від двониткових розривів ДНК, тим самим запобігаючи механізмам відновлення ДНК в клітині приєднуватися до хромосом кінець.

Інша перевага повторюваних послідовностей, які не кодують білки, полягає в тому, що втрата частини повторів не призводить до втрати важливої інформації про кодування. Таким чином, повтори виступають в ролі своєрідної буферної зони, де втрата послідовності не прирікає осередок. Однак вкорочення хромосом не може тривати нескінченно довго. Після певної кількості циклів реплікації клітини, як відомо, припиняють ділення і вступають у стан, відомий як реплікативне старіння. Це говорить про те, що укорочення теломерів служить своєрідним годинником, при цьому мірою старіння служить ступінь усадки хромосом. Зрештою клітини, які входять в старіння, загинуть.

Малюнок 7.28 - Хромосоми з теломерами, позначеними білим кольором

Проблеми з втратою послідовності

Навіть якщо наші клітини здатні функціонувати з коротшими хромосомами протягом нашого життя, це залишає нас з іншою проблемою. Якщо наші хромосоми з віком ростуть коротше, то імовірно, наші діти, які успадковують наші хромосоми, народяться з більш короткими хромосомами, ніж ми почали з. Вони, в свою чергу, мали б свої хромосоми скорочуватися в міру дорослішання, а їхні діти мали б ще коротші хромосоми. Протягом декількох поколінь це призвело б до того, що подальша усадка хромосом призведе до клітин, які ввійдуть у старіння дуже рано в житті і незабаром вмирають. Цього явно не відбувається. Покоління за поколінням діти народжуються з повнорозмірними хромосомами, тому існує механізм, який повинен забезпечити, щоб хоча б в репродуктивних клітині хромосоми не ставали коротшими.

Щоб зрозуміти цей механізм, необхідно спочатку дослідити кінець новоствореної молекули ДНК (рис. 7.29). У той час як провідна пасмо, яка росте в тому ж напрямку, що і рух вилки реплікації, може копіювати свій шаблон до кінця, відстає пасмо стикається з проблемою. РНК-праймери, як ми зазначили, необхідні для запуску кожного з фрагментів Окадзакі відстаючої пасма. Праймери необхідно видалити пізніше, а нуклеотиди РНК замінити нуклеотидами ДНК. Коли праймер РНК через кінець батьківської нитки видаляється, нуклеотиди РНК не можуть бути замінені нуклеотидами ДНК, оскільки ДНК-полімераза не має праймера для початку. Коротка область шаблону не може бути скопійована.

Малюнок 7.29 - Реплікація лінійної хромосоми призводить до втрати послідовностей на самих кінцях при кожному раунді реплікації

Теломераза

Як можна вирішити цю проблему? З малюнка 7.29 видно, що кінець вихідної шаблонної пасма має короткий 3' звис в результаті видалення праймера РНК поперек від нього. Для того щоб заповнити цю область, знадобиться ще один праймер, розташований за кінець шаблонної пасма. Але для того щоб спорудити таку грунтовку, потрібно, щоб шаблонний звис був довшим. Якби можна було зробити шаблонну пасмо довшою, то поперек від її кінця можна було б розмістити ще один праймер і скопіювати кінець пасма. Таке подовження шаблонної пасма - це саме те, що відбувається в наших репродуктивних клітині. Батьківська шаблонна пасмо подовжується ферментом теломеразою, яка додає теломер, повторює і подовжує шаблон. Незабаром ми побачимо, як він здійснює цей подвиг.

Шаблон РНК

Теломераза є незвичайним ферментом, в тому, що вона складається з двох компонентів, РНК і зворотної транскриптази. Зворотна транскриптаза - це РНК-залежна ДНК-полімераза, фермент, який копіює шаблон РНК для створення ДНК. РНК-компонент теломерази людини, званий HTERC, має послідовність, яка доповнює теломерний повтор, TAGGG. Як видно на малюнку 7.31, ця РНК може база-пара з останньою теломером повторюватися на батьківській ланцюжку ДНК, тоді як частина РНК залишається непарною.

Малюнок 7.30 - Теломераза тримає шаблон РНК (в центрі) - Вікіпедія

Шаблон для розширення

Функція непарної області РНК полягає в тому, щоб служити шаблоном, який може бути використаний для розширення нависаючого 3' кінця вихідної молекули ДНК. Білковий компонент теломерази має зворотну транскриптазну активність і може копіювати послідовність РНК в ДНК. У людської теломерази білковий компонент відомий як HTERT (теломераза зворотна транскриптаза). Як видно на малюнках 7.31 та 7.32, зворотна транскриптаза розширює початковий 3' звис, використовуючи компонент РНК як його шаблон. Потім теломераза може дисоціювати і повторити процес кілька разів, щоб додати багато повторів послідовності теломер.

Малюнок 7.31 - Теломераза розширює нитку шаблону, використовуючи власну РНК як шаблон - Вікіпедія

Малюнок 7.32 - Вирощування теломерів за допомогою теломерази і ДНК-полімерази. Спочатку 3-футовий кінець шаблону розширюється теломеразою, потім ДНК-полімераза завершує синтез відстаючої нитки

Після того, як звис був продовжений додаванням принаймні декількох повторів теломерів, тепер є місце для синтезу праймера РНК, що доповнює недавно розширений звис (спрямований назад до решти хромосоми). Потім цей праймер можна продовжити до повного синтезу відстаючої пасма аж до кінця вихідної батьківської нитки ДНК. Таким чином, додавання теломерних повторів на батьківських нитках ДНК утримує новоспечені нитки ДНК від того, щоб ставати коротшими з кожним циклом реплікації. Той факт, що це відбувається в статевих клітині (репродуктивних), пояснює, чому кожне покоління не має коротших хромосом, ніж батьківське покоління.

Функція коректури ДНК-полімераз контролює точність реплікації ДНК, тоді як фермент теломераза утримує хромосоми, які будуть передаватися потомству від укорочення. Між ними ці дві заходи забезпечують точне копіювання генетичної інформації та отримання наступних поколінь повного доповнення генетичної інформації.

Розбирання і повторна збірка нуклеосом

Події реплікації мають додатковий поворот у еукаріот. Нагадаємо, що ДНК міститься в еукаріотичних клітині у вигляді хроматину, комплексу ДНК з білками. Як мінімум конденсований, хроматин виглядає як нитка бісеру, що складається з ДНК, обгорнутої навколо гістонових сердечників, щоб зробити нуклеосоми. Структура нуклеосом повинна бути порушена, щоб зробити ДНК доступною для реплікації і відновити після завершення реплікації (рис. 7.33).

Попереду вилки реплікації структура хроматину розбирається АТФ-залежними комплексами ремоделювання хроматину, що дозволяють отримати доступ до шаблону ДНК. Після того, як нові нитки ДНК були синтезовані, як оригінальні нуклеосоми, так і нові нуклеосоми повинні бути зібрані за виделкою реплікації. Оскільки реплікація породжує дві молекули ДНК, де була одна, для упаковки ДНК потрібна вдвічі більша кількість гістонів. Підготовка до реплікації ДНК, отже, передбачає синтез великої кількості гістонів для забезпечення потреби. Цікаво, що здається, що новосинтезована ДНК упаковується в нуклеосоми з використанням оригінальних гістонів, які були витіснені, щоб дозволити пройти вилку реплікації, а також знову синтезовані гістони.

Ми також знаємо, що посттрансляційні модифікації, такі як ацетилювання, метилювання або фосфорилювання гістонів, можуть регулювати ступінь, до якої дана область генома доступна для використання. Одне питання, яке залишається предметом інтенсивних досліджень, полягає в тому, як ці модифікації точно передаються новим нуклеосомам.

Малюнок 7.33 - Розрив нуклеосом під час реплікації ДНК - Вікіпедія