6.6: Нуклеотиди

Джерело: BiochemFFA_6_6.pdf. Весь підручник доступний безкоштовно від авторів за адресою http://biochem.science.oregonstate.edu/content/biochemistry-free-and-easy

Різноманітні функції нуклеотидів

Нуклеотиди найчастіше розглядаються як будівельні блоки нуклеїнових кислот, ДНК і РНК. Хоча це, звичайно, життєво важлива функція, нуклеотиди грають і інші важливі ролі в клітині. Трифосфати рибонуклеозиду, такі як АТФ, CTP, GTP і UTP, необхідні не тільки для синтезу РНК, але і як частина активованих проміжних продуктів, таких як УДП-глюкоза в біосинтетичних шляхах. АТФ також є універсальною «енергетичною валютою» клітин, а зв'язок енергетично несприятливих реакцій з гідролізом АТФ робить можливим безліч реакцій в наших клітині, які вимагають введення енергії. Аденіннуклеотиди служать компонентами NAD (P) + і FAD. Нуклеотиди також можуть служити алостеричними і метаболічними регуляторами. Таким чином, шляхи синтезу та розпаду нуклеотидів та отриманих з них молекул мають життєво важливе значення для клітин. Регулювання синтезу нуклеотидів, особливо для дезоксирибонуклеотидів, важливо для забезпечення того, щоб чотири нуклеотиди були зроблені в правильних пропорціях, оскільки дисбаланс концентрацій нуклеотидів може призвести до збільшення швидкості мутації.

Шляхи метаболізму нуклеотидів організовані в дві основні групи і одну незначну. До них відносяться, відповідно, метаболізм 1) пуринів; 2) піримідинів; і 3) дезоксирибонуклеотидів. Кожну групу можна додатково розділити на шляхи, які роблять нуклеотиди з простих попередників (шляхи de novo) та інші, які використовують шматочки нуклеотидів для повторного складання повних (рятувальні шляхи). Примітно, що шляхи синтезу de novo для всіх нуклеотидів починаються з синтезу рибонуклеотидів. Дезоксирибонуклеотиди виготовляються з рибонуклеотидів.

Пуриновий нуклеотидний обмін

Синтез пуринових нуклеотидів шляхом de novo починається з додавання пірофосфату до вуглецю 1 рибозо-5-фосфату, створюючи фосфорибозілпирофосфат (PRPP). Реакція каталізується PRP-синтетазою. Деякі нумерують пуриновий метаболічний шлях, починаючи з наступної реакції. Тому ми дали цій реакції число нуля на малюнку 6.172.

На наступному етапі (реакція 1 на рис. 6.172) пірофосфат замінюється аміном з глютамина в реакції, каталізованої PRPP амідотрансферазою (PPAT). Засіб являє собою 5-фосфорибозиламін (5-ПРА).

PPAT є важливим регулюючим ферментом для біосинтезу пуринів. Кінцеві продукти шляху, AMP і GMP як інгібують фермент, так і PRPP активізує його. Цікаво, що повне інгібування ферменту вимагає зв'язування як AMP, так і GMP.

Зв'язування лише одного з двох нуклеотидів дозволяє ферменту залишатися частково активним, щоб можна було синтезувати відсутній нуклеотид. За допомогою цього ферменту контролюються відносні кількості АТФ і ГТП.

5-PRA є дуже нестабільним хімічно (період напіврозпаду 38 секунд при 37° C), тому було запропоновано, що він транслюється безпосередньо з PRPP амідотрансферази до GAR синтетази для наступної реакції.

У цій реакції (#2) гліцин додається до зростаючої структури вище рибозо-5-фосфату для створення гліцинеаміду рибонуклеотиду (GAR). Ця реакція, яка вимагає АТФ, каталізується, як зазначалося, ферментом GAR синтетазою.

У реакції #3 формульна група переноситься на GAR з N10-форміл-тетрагідрофолату (N10-форміл-ТГФ або FTHF) фосфорибозілгліцинамідформідформідформідфорнілтрансферази (GART).

Далі подвійний пов'язаний кисень у кільці замінюється аміном в реакції, каталізованої фосфорибозилформілгліцинамідинсинтазою (ПФАС), яка використовує глютамін і виробляє глутамат. Реакція вимагає енергії від АТФ (зверху наступної колонки).

У людей синтетаза GAR, фосфорибозілгліцинамідформідформілтрансфераза та фермент, що каталізує наступну реакцію (#5), активність синтетази AIR знаходяться на одному білку, відомому як трифункціональний пуриновий біосинтетичний білок аденозин-3.

У реакції #6 відбувається карбоксилювання AIR, каталізується фосфорибосиламіноімідазолкарбоксилазою (PAIC)

Потім додають аспарагінову кислоту, щоб пожертвувати свою амінну групу, і фумарат буде втрачений у реакції, яка слідує за цією. Фермент, який бере участь тут, - фосфорибозил-аміноімідазол-сукцинокарбоксамідсинтаза (ПАІКС)

При наступній реакції виділяється вуглецева оболонка аспартату (у вигляді фумарату) і амін залишається позаду. Реакція каталізується аденілосукцинат-ліазою (ADSL).

Реакція #9 включає в себе іншу реакцію формування, каталізовану фосфорибосиламіноімідазолкарбоксамідформідформідформідформідтрансферазою (ATIC-E1).

Далі інозинмонофосфатсинтаза (ATIC-E2) каталізує вивільнення води з утворенням першої молекули, класифікованої як пурин - інозинмонофосфат або IMP).

Хоча він не з'являється в ДНК, IMP насправді зустрічається в антикодоні багатьох ТРНК, де його здатність з'єднуватися з численними основами є цінною для читання генетичного коду.

IMP - це точка відгалуження між шляхами, які ведуть до GMP або AMP. Шляхи до GMP протікають за допомогою каталізу за допомогою дегідрогенази IMP наступним чином:

На останньому етапі синтезу GMP синтаза GMP каталізує трансамінацію, утворюючи GMP, використовуючи енергію від АТФ.

Джерелом енергії є АТФ має сенс, оскільки клітина, імовірно, робить GMP, оскільки їй потрібні гуанінові нуклеотиди. Якщо в клітині мало гуанінових нуклеотидів, GTP буде в дефіциті.

Синтез нуклеотидів аденіну

Далі відбувається синтез AMP з IMP. По-перше, аденілосукцинат-синтетаза каталізує додавання аспартату до IMP, використовуючи енергію з ГТП.

Потім аденілосукцинат-ліаза розщеплює фумарат, щоб отримати AMP.

У людини біфункціональний білок біосинтезу пурину, відомий як PURH, містить активність останніх двох ферментів вище.

Скорочення, використані вище

• PRPP = Фосфорибозил пірофосфат
• 5-ПРА = 5-фосфорибозиламін
• GAR = гліцинеамід рибонуклеотид
• FGAR = Фосфорибозил-N-формілгліцинемід
• THF = Тетрагідрофолат
• FthF = N10-форміл-тетрагідрофолат
• FGAM = 5'-фосфорібозилформілгліцинамідин
• AIR = 5-аміноімідазол риботид
• CAIR = 5'-фосфорібозил-4-карбокси-5-аміноімідазол
• SAICAR = Фосфоріламіно-імідазолюцинокарбоксамід
• AICAR = 5-аміноімідазол-4-карбоксамід рибонуклеотид
• FAICAR = 5-формамідоімідазол-4-карбоксамід риботид
• IMP = інозин монофосфат

Регулювання

Варто повторити, що синтез GMP від IMP вимагає енергії від АТФ і що синтез AMP з IMP вимагає енергії від GTP. Крім того, ферменти, що перетворюють IMP в проміжні продукти в шляхах AMP та GMP, є зворотним зв'язком, пригніченим відповідним монофосфатним нуклеотидом. Таким чином, IMP дегідрогеназа інгібується GMP (кінцевий продукт гілки шляху), а аденілосукцинат-синтетаза інгібується AMP, кінцевим продуктом цієї гілки шляху.

Рівні пуринових нуклеотидів збалансовані комбінованою регулюванням PRPP амідотрансферази, IMP дегідрогенази, аденілосукцинатсинтетази та нуклеотидів AMP і GMP. Важливість регуляторної схеми пуринів ілюструється двома прикладами. По-перше, уявіть, як AMP, так і GMP в достатку. Коли це станеться, PRPP амідотрансфераза буде повністю пригнічена і синтез пурину не відбудеться.

Часткова активність

Високий рівень GMP та низький рівень AMP призведуть до того, що амідотрансфераза PRPP буде трохи активною, через те, що GMP заповнить один алостеричний сайт, але низький рівень AMP означатиме, що другий аллостеричний сайт, ймовірно, буде незаповнений. Це знижена (але не повністю пригнічена) активність PRPP амідотрансферази дозволить обмежити виробництво 5-PRA та решти проміжних продуктів шляху, тому вона залишатиметься активною.

Однак у відділенні IMP високий рівень GMP буде пригнічувати дегідрогеназу IMP, тим самим закриваючи цю гілку та дозволяючи всім проміжним продуктам направляти на виготовлення AMP. Коли рівень AMP підвищується досить високо, AMP зв'язується з PRPP амідотрансферазою і разом з GMP відключає фермент. Розворот відбудеться, якщо рівні AMP високі, але рівні GMP низькі.

Правильний баланс

Регульований таким чином, рівні AMP і GMP можуть підтримуватися в досить вузькому діапазоні концентрацій. Правильне врівноваження рівня нуклеотидів у клітині є критичним. Цілком ймовірно, що з цієї причини клітини мають численні контролі над кількістю кожного виробленого нуклеотиду.

інші механізми

Клітини мають ще два способи врівноваження нуклеотидів GMP і AMP. По-перше, фермент GMP редуктаза перетворить GMP назад в IMP за допомогою електронів від NADPH.

IMP, у свою чергу, може бути перетворений в AMP, якщо його концентрація низька. По-друге, AMP може бути перетворений назад в IMP ферментом AMP деамінази. У цьому випадку IMP може бути перетворений в GMP.

Важливо підтримувати відповідні пропорції різних нуклеотидів. Надлишок або дефіцит будь-якого нуклеотиду будь-якого нуклеотиду може призвести до підвищеної схильності до мутації.

Для перетворення AMP в АТФ і GMP в GTP потрібна дія ферментів кінази. Кожна монофосфатна нуклеотидна форма має свою специфічну нуклеозидмонофосфаткіназу. Для аденинсодержащих нуклеотидів (рибозних форм і форм дезоксирибози) аденилаткіназа каталізує відповідну реакцію.

Реакція аденілаткінази є оборотною і використовується для генерації АТФ, коли концентрація АТФ в клітині низька. Коли АТФ виготовляється з 2 ADP таким чином, рівень AMP збільшується, і це один із способів, коли клітина відчуває, що вона низька енергія.

Монофосфати гуанозинів також мають власну кіназу, і вона каталізує реакцію у верхній частині наступної сторінки.

Інші монофосфаткінази для UMP і CMP використовують АТФ аналогічним чином.

У переході від дифосфатної форми в трифосфатну форму картина проста - один фермент каталізує реакцію для всіх дифосфатів (рибозной і дезоксирибозной форм). Він відомий як нуклеозиддифосфаткіназа або (частіше) NDK або NDPK і каталізує реакції форми

де X і Y відносяться до будь-якої бази.

Реакції порятунку пурину

Не всі нуклеотиди в клітці зроблені з нуля. Альтернативами синтезу de novo є рятувальні шляхи. Реакції порятунку пуринових нуклеотидів починаються з приєднання рибози до пуринових основ за допомогою фосфорибозілпірофосфату (PRPP).

Фермент, що каталізує цю реакцію, відомий як гіпоксантин/гуанін фосфорібозилтрансфераза (HGPRT - рис. 6.175) і цікавий з ензимологічної, а також медичної точки зору. По-перше, фермент здатний каталізувати обидві наступні дві важливі реакції порятунку - перетворення гіпоксантину в IMP або гуанін в GMP.

HGPRT здатний зв'язувати різні субстрати на своєму активному місці і навіть, здається, пов'язує ненатуральні субстрати, такі як ацикловір переважно над його природними.

Медична перспектива

З медичної точки зору зниження рівня HGPRT призводить до гіперурикемії, стану, коли концентрація сечової кислоти збільшується в організмі. Повна відсутність HGPRT пов'язана з синдромом Леша-Найхана, рідкісне, спадкове захворювання з високою концентрацією сечової кислоти по всьому тілу пов'язане з важкими супутніми неврологічними розладами.

Зниження вироблення HGPRT зустрічається часто у чоловіків і має менший наслідок (подагра), ніж повна відсутність. Цікаво, що подагра була пов'язана зі зниженою ймовірністю зараження розсіяним склерозом, припускаючи, що сечова кислота може допомогти запобігти або покращити захворювання.

Експресія HGPRT стимулюється HIF-1, фактором транскрипції, зробленим в тканині, коли кисень обмежує, припускаючи роль для HGPRT в цих умовах.

Аденін порятунок

Фермент, відомий як аденінфосфорібозилтрансфераза (APRT), каталізує реакцію, відповідну HGPRT для порятунку аденінових основ.

Піримідиновий нуклеотидний метаболізм

Шляхи de novo для синтезу піримідинових нуклеотидів має приблизно таку ж кількість реакцій, що і пуриновий шлях, але також має іншу стратегію. У той час як пурини були синтезовані приєднані до цукру рибози, піримідинові основи виготовляються окремо від рибози, а потім прикріплюються пізніше.

Першу реакцію каталізує карбамоїлфосфатсинтетаза (рис. 6.176).

Дві різні форми знаходяться в еукаріотичних клітині. Форма I зустрічається в мітохондріях, а форма II - в цитоплазмі.

Реакція, каталізована карбамоїлфосфатсинтетазою, є кроком обмеження швидкості біосинтезу піримідину і відповідає реакції 1 на малюнку 6.178.

Баланс

Фермент активується АТФ і PRPP і інгібується UMP. Це допомагає збалансувати концентрацію піримідину проти пурину. Висока концентрація пурину (АТФ) активізує синтез піримідинів. PRPP збільшується в концентрації, оскільки концентрація пурину збільшується, тому це теж допомагає встановити цей баланс. UMP є кінцевим продуктом обміну піримідину, тому процес є самообмежуючим. Наступний фермент на шляху, аспартататранскарбамойлаза (ATCase) також відіграє роль в тому ж балансі, як ми побачимо. Реакція, яку вона каталізує, показана нижче і є реакцією 2 на малюнку 6.178.

ATCase - класичний фермент, що проявляє аллостеричну регуляцію та інгібування зворотного зв'язку, що має як гомотропні, так і гетеротропні ефекти (рис. 6.179 і див. ТУТ). При 12 субодиницях (6 регуляторних і 6 каталітичних одиниць) фермент існує в двох станах - Т-стані низької активності і R-стані високої активності. Зв'язування аспартатного субстрату з активною ділянкою зміщує рівновагу на користь R-стану.

Аспартат є гомотропним ефектором ферменту, оскільки він діє алостерично на фермент і є субстратом для нього. Аналогічно, прив'язка СПС до регуляторних підрозділів сприяє R-державі, тоді як прив'язка ОСАГО до регуляторних підрозділів сприяє T-державі. АТФ і CTP є гетеротропними ефекторами ферменту, оскільки вони не є субстратами для нього, а діють алостерично.

Регулювання

Як було помічено з першим ферментом шляху, висока концентрація пуринових нуклеотидів стимулює синтез піримідинів і висока концентрація піримідинів відключає шлях, який їх синтезує.

Дигідроротаза каталізує реакцію 3 і виявляється в цитоплазмі, як і в AtCase.

Реакція 4 відбувається в мітохондріоні, тому продукт реакції 3, дигідророротат, повинен транспортуватися в мітохондріон з цитоплазми. У реакції 4 дигідророротат окислюється до оротат. Ферментом, що каталізує реакцію, є дигідроротатдегідрогеназа.

Реакція #5, каталізована оротат фосфорибозилтрансферазою, передбачає з'єднання оротату з рибозою з отриманням нуклеотиду - оротидин-5'-монофосфату (ОМП).

Нарешті, OMP перетворюється в уридин-5'-монофосфат (UMP) під дією захоплюючого ферменту, відомого як OMP декарбоксилаза.

OMP декарбоксилазу часто наводять як приклад неймовірної здатності ферменту прискорювати реакцію. Декарбоксилювання ОМП, якщо дозволяється протікати при відсутності ферменту, займає близько 78 мільйонів років. При наявності ОМП декарбоксилази реакція відбувається за 18 мілісекунд, збільшення швидкості приблизно на 1017. Примітно, що фермент робить це без будь-яких кофакторів або коферментів будь-якого роду.

Механізм дії ферменту показаний на малюнку 6.180. У ссавців діяльність ОМП декарбоксилази і оротата фосфорібозилтрансферази міститься на одному білку.

Монофосфаткіназа (UMP/CMP кіназа) каталізує перетворення UMP в UDP.

Той же фермент також буде фосфорилювати CMP до CDP і dCMP до DCDP. Як і реакція аденілаткінази, реакція вище, при запуску в зворотному напрямку, може бути джерелом АТФ, коли клітина має низький рівень енергії.

Наступний крок, каталізований НДПК, використовує енергію будь-якого трифосфатного нуклеотиду (XTP) для отримання UTP з UDP.

CTP синтаза

UTP є субстратом для синтезу CTP за допомогою каталізу CTP-синтазою.

Цей фермент інгібується своїм продуктом, гарантуючи, що занадто багато CTP не виробляється і активується фізіологічними концентраціями АТФ, ГТП та глютаміну. Показано, що один ізоцим людини, CTPS 1, інактивується фосфорилуванням глікогенсинтазою кінази 3.

Синтаза CTP має два домени і є гетеродимером (рис. 6.183). Він існує у вигляді неактивного мономера при низьких концентраціях ферментів або при відсутності UTP і АТФ. Один домен ферменту розщеплює амінну групу від глютамина і передає її внутрішньо в UTP. Інший домен (домен синтази) пов'язує АТФ і ініціює механізм, показаний на малюнку 6.184 для створення ОСАГО.

CTP - єдиний нуклеотид, синтезований de novo безпосередньо як трифосфат, оскільки він виникає безпосередньо з UTP. Оскільки дезоксирибонуклеотиди виготовляються з дифосфатів рибонуклеозидів, це означає, що нуклеотиди дезоксицитидину повинні бути виготовлені переважно з рятувальних нуклеотидів, або спочатку слід дефосфорилювати CTP.

Одним з ферментів, який може це зробити, є мембранно-зв'язаний фермент, відомий як апіраза, який послідовно перетворює CTP в CDP, а потім CMP.

Реакції порятунку піримідину

Синтез порятунку піримідину дозволяє клітинам переробляти нуклеотиди піримідинтрифосфату, починаючи з C або U піримідинових основ, нуклеозидів або нуклеотидів. На малюнках 1.85 & 6.186 зображені реакції на шляху порятунку. Як видно на малюнку 1.86, існує кілька способів створення одних і тих же молекул. Наприклад, урацил може бути зроблений в уридин реакцією 11 або реакцією 12.

На малюнку зображений не тільки синтез CTP і UTP з основних компонентів, але і показано, як ці нуклеотиди можуть бути розбиті на більш дрібні шматочки.

У багатьох випадках один і той же фермент діє на молекули цитидину, уридину та дезоксицитидину.

Ферменти ноти

У рятувальному шляху є кілька ферментів примітки. Сім ферментів, наприклад, працюють як на урацил, так і на цитозин, що містять нуклеозиди/нуклеотиди. До них відносяться NTP-фосфатаза (реакція 2), НДПК (реакція 3), апіраза (реакція 4), НДП фосфатаза (реакція 5), UMP/CMP кіназа (реакція 6), піримідин-специфічна 5' нуклеотидаза (реакція 7) та уридин/цитидинкіназа (реакція 8). Ферменти для реакцій 6 і 8 також можуть використовувати дезоксирибонуклеозиди/дезоксирибонуклеотиди в якості субстратів.

Цитидиндеаміназа (реакція #9) перетворює цитидин в уридин шляхом видалення амінної групи з основи цитозину і, таким чином, є лічильником для реакції UTP до CTP, каталізованої синтетазою CTP. Протипоказані реакції дозволяють клітинам збалансувати концентрації нуклеозидів/нуклеотидів в будь-якому напрямку, якщо вони повинні вийти з рівноваги.

Дві інші реакції на малюнку варто згадати. І UTP, і CTP перетворюються в процесі пробою в UMP і CMP відповідно. Обидві ці реакції важливі для дезоксирибонуклеотидного обміну. У кожному випадку похідні монофосфату фосфорилюються, створюючи похідні дифосфату (UDP та CDP), які є субстратами для РНР, які дають dUDP і DCDP відповідно. dUDP фосфорилюється до dUTP, а потім пірофосфат видаляється DutPase з отриманням dUdP. dUdP є субстратом для синтезу тимідину (див. ТУТ). dCDP перетворюється на dCTP за допомогою НДПК

Дезоксирибонуклеотидний метаболізм

Дезоксирибонуклеотиди, будівельні блоки ДНК, виготовляються майже виключно з рибонуклеозиддифосфатів. Один фермент під назвою рибонуклеотидредуктаза (РНР) відповідає за перетворення кожного з них в дезокси-форму (рис. 6.187). Субстратами ферменту є дифосфати рибонуклеозидів (ADP, GDP, CDP або UDP), а продукти - дезоксирибонуклеозидні дифосфати (dAdP, dGDP, DCDP або DuDP). Нуклеотиди тимідину синтезуються з DuDP.

РНР має дві пари двох однакових субодиниць - R1 (велика субодиниця) і R2 (мала субодиниця). R1 має два вузли аллостеричного зв'язування і каталітичний сайт. R2 утворює радикал тирозину, необхідний для механізму реакції ферменту.

Існує три класи ферментів RNR, і вони відрізняються за характером або засобами генерації радикала, що використовується в каталітичному механізмі ферменту. РНР I класу містяться в еукаріотів, еубактерій, бактеріофагів та вірусів. Всі вони використовують центр заліза, який втрачає електрон (перетворюючись на залізо заліза), щоб генерувати вільний радикал на тирозинному кільці. Ці ферменти працюють тільки в аеробних умовах.

Клас II RNR використовують 5'-дезоксиаденозил кобаламін (вітамін B12) генерувати радикал і працювати в аеробних або анаеробних умовах. Вони містяться в еубактеріях, архебактеріях та бактеріофагах. RNR класу III генерують радикал гліцину, використовуючи S-аденозилметіонін (SAM) та залізо-сірчаний центр. Вони працюють в анаеробних умовах і використовуються архебактеріями, еубактеріями та бактеріофагами. Субстратами для ферментів I класу є рибонуклеозиддифосфати. Ферменти класу II працюють на рибонуклеозиддифосфати або рибонуклеозидтрифосфати. Ферменти класу III працюють на рибонуклеозидтрифосфати.

У ферментах I класу RNR - це залізозалежний димерний фермент, причому кожна мономерна одиниця містить велику субодиницю (відому як α або R1) і малу субодиницю (відому як β або R2). Субодиниця R1 містить регуляторні вузли зв'язування для аллостеричних ефекторів (див. Нижче), тоді як субодиниця R2 містить залишок тирозину, який утворює радикал, критичний для механізму реакції ферменту. Електрони, необхідні в реакції, передаються від НАДПГ до ферменту одним з двох шляхів, зменшуючи дисульфідний зв'язок в ферменті до двох сульфгідрилів. У першому механізмі передачі NADPH передає електрони глутатіону, який передає їх глутаредоксину, який потім дарує їх ферменту RNR, який використовується в реакції. У другому механізмі NADPH передає електрони FAD, який використовує їх для зменшення тіоредоксину, який потім передає електрони до РНР з тим же кінцевим результатом, що і в першому шляху - зменшення суфлідрилу в РНР.

У реакційному механізмі (рис. 6.188) бічний ланцюг тирозину в блоці R2 повинна бути радикалізована для початку. Ця електронна зміна передається через малу субодиницю R2 на активну ділянку великої субодиниці R1. Вважається, що кілька бічних ланцюгів ароматичних амінокислот відіграють певну роль у цьому процесі. Атоми заліза в субодиниці R2 допомагають у створенні і стабілізації радикала. Тирозинний радикал містить непарний електрон, делокалізований поперек його ароматичного кільця.

Перенесення електронної нестабільності в блок R1 призводить до радикалізації цистеїну (з утворенням тіїльного радикала) на активній ділянці. Утворений таким чином тіїловий радикал абстрагує атом водню (протон плюс електрон) з вуглецю 3 рибози на зв'язаному рибонуклеозиддифосфаті, створюючи радикальний атом вуглецю. Радикалізація вуглецю #3 сприяє вивільненню гідроксильної групи на вуглеці #2 у вигляді води. Додатковий протон надходить із сульфгідрилу цистеїну ферменту. На наступному етапі процесу протон і два електрони з того ж цистеїну переносяться у вуглець #2, а потім вуглець #3 повертає спочатку видалений з нього протон, щоб отримати дезоксирибонуклеозиддифосфат. Тіїльна група ферменту отримує електрон від R2, і дисульфідний зв'язок, створений в реакції, повинен бути відновлений електронами з NADPH знову, щоб знову каталізувати.

Регулювання

На додаток до незвичайного механізму реакції РНР, фермент також має складну систему регуляції, з двома наборами ділянок аллостеричного зв'язування, обидва знайдені в субодиниці R1. Оскільки один фермент, РНР, відповідає за синтез всіх чотирьох дезоксирибонуклеотидів, необхідно мати механізми для забезпечення того, щоб фермент виробляв правильну кількість кожного dNDP. Це критичний розгляд, оскільки дисбаланси в попередниках ДНК можуть призвести до мутації.

Отже, фермент повинен реагувати на рівні кожного дезоксирибонуклеотиду, вибірково роблячи більше тих, кого не вистачає, і запобігаючи додатковому синтезу тих, яких багато. Ці вимоги задовольняються наявністю двох окремих механізмів контролю на ферменті - один, який визначає, на який субстрат буде діяти, а інший, який контролює активність ферменту.

Два аллостеричні ділянки

РНР алостерично регулюється за допомогою двох молекулярних вузлів зв'язування - специфічного вузла зв'язування (зв'язує DNTP і індукує структурні зміни ферменту, який визначає, які субстрати переважно зв'язуються в каталітичному місці та місці контролю активності (контролює, чи активний фермент чи ні). Сайт контролю активності функціонує як простий перемикач включення/вимикання - АТФ активує каталіз, DatP інактивує його. (Однак на одну підмножину ферментів класу I не впливає DatP.)

Інактивація РНР датП є важливим фактором захворювання, відомого як важка комбінована імунодефіцитна хвороба (SCID). У SCID рятувальний фермент аденозиндеамінази є дефіцитним, що призводить до підвищення концентрації DatP в клітині імунної системи.DatP вимикає RNR в цих клітині, тим самим зупиняючи їх проліферацію і залишаючи уражену людину з дуже слабкою або відсутністю імунної системи.

Аллостеричні ефектори

Коли DTTP є рясним (рис. 6.189), він зв'язується з ділянкою специфічності РНР і пригнічує зв'язування та зменшення CDP та UDP, але стимулює зв'язування та зменшення ВВП на активному місці ферменту. І навпаки, прив'язка АТФ або DatP на конкретному сайті стимулює зв'язування і зниження CDP і UDP на активному сайті. Останнє, прив'язка dGTP до специфіки сайту (специфіка сайту B) індукує зв'язування та зменшення АДФ на активному сайті.

Студенти іноді плутають активний сайт РНР з сайтом контролю активності (іноді його називають сайтом активності). Активна ділянка - це місце, де реакція каталізується, і її краще назвати каталітичним сайтом, тоді як сайт активності - це місце аллостеричного зв'язування для АТФ або DATP, який контролює, чи активний фермент. Високий рівень DatP є показником того, що достатня кількість DNTP доступні, тому фермент інгібується, щоб зупинити виробництво більше. Низькі рівні датФ дозволяють зв'язувати АТФ і активувати фермент.

Крім регуляції дезоксирибонуклеотидами і АТФ, РНР може безпосередньо інгібуватися гідроксисечовиною.

Синтез DtTP

Синтез DTTP шляхом de novo включає багатоступінчастий процес від UDP до DTTP. Він починається з UDP, який перетворюється на dUDP за допомогою RNR. dUDP фосфорилюється NDPK для отримання dUTP, який швидко розбивається DutPase для отримання DutPase. Решта реакції показані на малюнку 6.190.

Важливі ферменти в шляху включають дутфазу і тиміділатсинтетазу. dutPase важлива для підтримки низької концентрації dUTP, тому вона не потрапляє в ДНК. ДНК-полімераза може використовувати dutP так само, як це робить DTTP, і включати його в ланцюг ДНК, навпроти аденінних нуклеотидів.

Тиміділатсинтетаза важлива, оскільки вона є мішенню (прямо та опосередковано) для протипухлинної терапії. Як показано на малюнку 6.191, метильна група з N5, N10-метилен-тетрагідрофолат (часто називається тетрагідрофолат) подається DumP, роблячи DTMP і дигідрофолат (DHF). Молекули фолатів знаходяться в обмеженій кількості в клітині і повинні бути перероблені, тому що якщо їх немає, то реакція на створення DTMP не може відбутися. Переробка дигідрофолату в тетрагідрофолат відбувається реакцією, показаною на малюнку 6.192.

Фермент, який бере участь у перетворенні дигідрофолату в тетрагідрофолат, дигідрофолатредуктазу (DHFR - рис. 6.192), є однією мішенню протипухлинних препаратів, оскільки, зупиняючи регенерацію тетрагідрофолату з дигідрофолату (інакше тупик), можна зупинити вироблення тимідиннуклеотидів і, як в результаті, зупинити синтез ДНК, тим самим запобігаючи ділення ракової клітини. Конкурентні інгібітори ДХФР включають метотрексат (рис. 6.194) або аміноптерин. Клітини містять численні фолати для здійснення одного вуглецевого обміну, а шляхи, за допомогою яких вони всі переробляються, показані на малюнку 6.193.

5-фторурацил

Ще один важливий інгібітор синтезу тимідину використовується для лікування раку. Ця сполука, 5-фторурацил (рис. 6.195 і фільм 6.3) є інгібітором суїциду тимідилатсинтази.

Синтез порятунку

Крім синтезу з простих попередників, нуклеотиди можуть бути зроблені і зі шматочків існуючих. Це особливо актуально, оскільки споживання їжі вводить в організм велику колекцію білків, ліпідів і нуклеїнових кислот, які все ефективніше переробляються, ніж деградують. Для білків процес нескладний. Травлення перетворює їх у складові будівельні блоки (амінокислоти), і вони знову збираються в білки споживаючого організму за допомогою генетичного коду.

нуклеотиди

Багатокомпонентна структура нуклеотидів, хоча (основа, цукор, фосфат) означає, що підрозділи їх можуть бути повторно утилізовані. Фосфат переробляється просто шляхом потрапляння в фосфатний басейн клітини. Він, як правило, вбудований назад в трифосфатні форми (в кінцевому рахунку) шляхом окислювального фосфорилювання і дії кінази. Порятунок підстав відрізняється для пуринів і піримідинів і обговорюється окремо ТУТ і ТУТ.

Нуклеотидний катаболізм

Окрім порятунку та вбудовування в нуклеїнові кислоти, нуклеотиди також можуть бути розщеплені на більш прості складові молекули. Деякі з цих молекул, такі як сечова кислота, можуть мати значний вплив на організми (див. ТУТ).

катаболізм пурину

Розпад пуринових нуклеотидів починається з нуклеозидних монофосфатів, які можуть вироблятися при розпаді РНК, наприклад, нуклеазою (рис. 6.196).

Метаболізм AMP і GMP сходяться при ксантині. Спочатку АМФ дефосфорилюється нуклеотидазою для створення аденозину, який потім дезамінірується аденозиндеаміназою з отриманням інозину. Крім того, AMP можна дезінфікувати за допомогою AMP-демінази, щоб отримати IMP.

IMP також є проміжним продуктом у шляху синтезу пуринового анаболізму. Дефосфорилювання IMP (також за допомогою нуклеотидази) дає інозин. Інозин має рибозу, позбавлену від нього під дією пуриннуклеотидної фосфорилази для вивільнення гіпоксантину. Гіпоксантин окислюється до ксантину в реакції, що генерує перекис водню, каталізованої ксантиноксидазою.

Катаболізм GMP протікає самостійно, хоча аналогічно. Спочатку фосфат видаляють нуклеотидазою з отриманням гуанозину. Гуанозин позбавлений рибози, щоб отримати вільну гуанінову основу, яка дезамінірована гуаніновою деаміназою (також називається гуаназою) для отримання ксантину.

Ксантиноксидаза потрапляє на картину вдруге в наступній реакції, каталізуючи другу реакцію за аналогічним механізмом до описаного раніше окислення гіпоксантину. Це показано на наступній сторінці.

Сечова кислота

Сечова кислота є проблематичною у деяких вищих організмів (включаючи людину), оскільки вона не дуже розчинна у воді. Внаслідок цього вона випадає в осад з розчину, утворюючи кристали (рис. 6.198). Ці кристали можуть накопичуватися в суглобах і (часто) у великому пальці ноги. Такий стан відомо як подагра.

Цікаво, що може бути негативна кореляція між подагрою і зараженням розсіяним склерозом. Цей захисний ефект може бути обумовлений антиоксидантним захистом, який забезпечує сечова кислота. Сечова кислота є первинною формою виведення азоту для птахів. Собаки дальмації також виділяють сечову кислоту замість сечовини і можуть страждати від болю в суглобах внаслідок подагри, подібних до подагри.

Подагра лікується гіпоксантиновим аналогом, відомим як алопуринол (рис. 6.199). Він пригнічує дію ксантиноксидази, що сприяє збільшенню концентрації гіпоксантину. Останній використовується в рятувальному синтезі для отримання додаткових пуринів.

Сечова кислота може виводитися з сечею (у людини) або розщеплюватися на алантоїн ферментом уриказа. Оскільки людині не вистачає ферменту для вироблення алантоїну (сечовина у людини виробляється циклом сечовини), його присутність в організмі означає, що вона була вироблена неферментативним шляхом. Це прийнято вважати показником окислювального стресу, так як він алантоїн виробляється неферментативно шляхом окислення сечової кислоти.

катаболізм піримідину

Катаболізм нуклеотидів уридину і тимідину показаний вище (рис. 6.200). Катаболізм нуклеотидів цитидину протікає через уридин шляхом дезамінації цитозину. Вільні основи, тимін і урацил, вивільняються ферментом рибозілпіримідиннуклеозидази. У відновному шляху зниження урацилу і тиміну за допомогою NADPH дає дигідротимін і дигідроурацил відповідно. Додавання води до них створює 3-уреідоізобутират і 3-урейдопропионат відповідно. Гідроліз обох цих проміжних продуктів дає іон амонію та вуглекислий газ (які перетворюються на сечовину) плюс 3-аміноізобутират для тімінового шляху та β-аланін для продукту шляху урацилу. 3-аміноізобутират виробляється під час фізичних вправ і активує експресію термогенних генів у білому жирі клітини.

β-аланін є попередником карнозину, що обмежує швидкість, дипептид гістидину і β-аланіну (рис. 6.201). Карнозин функціонує як антиоксидант, який поглинає активні форми кисню. Він також діє як антиглікірующий агент, щоб запобігти приєднанню молекул цукру до білків. Це фактори дегенеративних захворювань і можуть відігравати певну роль у старінні.

Цукор

І останнє, але не менш важливе, цукри рибоза та дезоксирибоза можуть бути перероблені (рибоза) або катаболізовані (рибоза та дезоксирибоза). У випадку рибози він може бути повторно приєднаний до основ ферментами фосфорилази, такими як уридинфосфорилаза, або перетворений в PRPP з тією ж метою, щоб створити нуклеозиди. Рибоза-5-фосфат є проміжним продуктом у шляху пентози фосфату, що дозволяє йому перетворюватися в інші цукру або розщеплюватися при гліколізі.

Дезоксирибоза-5-фосфат можна розбити на дві частини дезоксирибозо-5-фосфатною альдолазою. Продукти цієї реакції - гліцеральдегід-3-фосфат і ацетальдегід. Перші можуть окислюватися при гліколізі, а другі можуть бути перетворені в ацетил-КоА для подальшого метаболізму.