4.3: Механізми каталізу

Last updated
Save as PDF

Page ID: 2480

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Версія для друку цього розділу знаходиться тут: BiochemFFA_4_3.pdf. Весь підручник доступний безкоштовно від авторів за адресою http://biochem.science.oregonstate.edu/content/biochemistry-free-and-easy

Магія ферментів, як зазначалося, полягає в їх здатності створювати електронні середовища, що сприяють ініціації реакції. Механізмів реакції більше, ніж ми могли б сподіватися висвітлити в такій книзі, і всебічне обговорення цього питання не є нашою метою. Замість цього наведемо кілька прикладів і детально зупинимося на одному з них - механізмі дії серінових протеаз.

Хімотрипсин

Почнемо з механізму дії одного ферменту - хімотрипсину. Знайдено в нашій травній системі, каталітична активність хімотрипсину розщеплює пептидні зв'язки в білках, і він використовує бічний ланцюг серину у своєму механізмі каталізу. Багато інших ферментів, що розрізають білок, використовують дуже схожий механізм, і вони разом відомі як серин-протеази (рис. 4.52).

Малюнок 4.52 - Місця зв'язування субстрату (кишені S1) трьох серин-протеаз. Зображення Алеї Кім

Ці ферменти знаходяться в прокаріотичних і еукаріотичних клітині і всі використовують загальний набір з трьох амінокислот в активному місці, який називається каталітичною тріадою (рис. 4.53). До його складу входять аспарагінова кислота, гістидин і серин. Серин активується в механізмі реакції з утворенням нуклеофіла в цих ферментах і дає класу їх назву. За винятком розпізнавання, яке відбувається в місці зв'язування субстрату, механізм, показаний тут для хімотрипсину, буде застосований до будь-якої з серин-протеаз.

Малюнок 4.53 - 1. Активна ділянка хімотрипсину, що показує каталітичну тріаду серину - гістидин-аспарагінової кислоти

специфіка

Як протеази хімотрипсин діє досить специфічно, розрізаючи не всі пептидні зв'язки, а тільки ті, які є сусідами з відносно неполярними амінокислотами в білку. Однією з амінокислот, які він ріже поруч, є фенілаланін. Дія ферменту відбувається у дві фази - швидка фаза, яка відбувається спочатку, і повільніша фаза, яка слідує за нею. Фермент має місце зв'язування субстрату, який включає область ферменту, відомого як кишеню S1. Давайте пройдемо через механізм, за допомогою якого хімотрипсин розрізає сусідні з фенілаланіном.

Обв'язка субстрату

Процес починається з прив'язки підкладки в кишені S1 (рис. 4.54). Кишеня S1 в хімотрипсині має гідрофобний отвір, в якому пов'язаний субстрат. Переважні субстрати включатимуть бічні ланцюги амінокислот, які є громіздкими та гідрофобними, як фенілаланін. Якщо іонізована бічна ланцюг, подібна до глутамінової кислоти, зв'язується в кишені S1, він швидко вийде, так само, як вода уникнула б маслянистого інтер'єру.

Малюнок 4.54 - 2. Прив'язка субстрату до кишені S1 в активному місці

Зміна форми при прив'язці

Коли належний субстрат зв'язується в кишені S1, його присутність викликає все так незначну зміну форми ферменту. Ця тонка зміна форми при зв'язуванні належної основи запускає етапи каталізу. Оскільки каталітичний процес починається лише тоді, коли належний субстрат зв'язується, це є причиною того, що фермент проявляє специфічність для різання конкретних амінокислот у цільовому білку. Тільки амінокислоти з бічними ланцюгами, які добре взаємодіють з кишенею S1, починають поворот каталітичних коліс.

Незначні зміни форми включають зміни в позиціонуванні трьох амінокислот (аспарагінової кислоти, гістидину та серину) в активному місці, відомому як каталітична тріада.

Зсув негативно зарядженої аспарагінової кислоти в бік багатого електронами гістидинового кільця сприяє абстрагуванню протона гістидином з гідроксильної групи на бічному ланцюзі серину, що призводить до вироблення дуже реактивного іона алкоксиду в активній ділянці (рис. 4.55).

Оскільки активний сайт в цій точці також містить поліпептидний ланцюг, позиціонується з боковим ланцюгом фенілаланіну, вбудованим в кишеню S1, іон алкоксиду здійснює нуклеофільну атаку на пептидний зв'язок на карбоксильної стороні фенілаланіну, що сидить в кишені S1 (рис. 4.56). Ця реакція розриває пептидний зв'язок (рис. 4.57) і призводить до двох речей.

Малюнок 4.57 - 5. Стабілізація за допомогою оксианіонного отвору. Розрив пептидного зв'язку.

Спочатку звільняється один кінець вихідного поліпептиду і виходить з активної ділянки (рис. 4.58). Друга полягає в тому, що кінець, що містить фенілаланін, ковалентно пов'язаний з киснем серінового бічного ланцюга. На цьому етапі ми завершили першу (швидку) фазу каталізу.

Малюнок 4.58 - 6. Перший пептид вивільняється. Інша половина скріплена з серином.

Повільніша друга фаза

Друга фаза каталізу хімотрипсином протікає повільніше. Це вимагає, щоб ковалентний зв'язок між фенілаланіном і киснем серину був порушений, щоб пептид міг бути вивільнений і фермент може повернутися до початкового стану. Процес починається з надходження води в активну ділянку. Вода піддається нападу подібно до серінового бічного ланцюга в першій фазі, створюючи реактивну гідроксильну групу (рис. 4.59), яка здійснює нуклеофільну атаку на фенілаланін-серіновий зв'язок (рис. 4.60), випускаючи її і замінюючи протон на серин. Другий пептид вивільняється в процесі і реакція завершується з ферментом назад в початковому стані (рис. 4.61).

Малюнок 4.59 - 7. Активація води гістидином

Малюнок 4.60 - 8. Атака нуклеофілів гідроксилом створює тетрагідрил проміжний, стабілізований оксианіонним отвором. Зв'язок з серином розривається.

Малюнок 4.61 - 9. Друга половина пептиду вивільняється. Фермент активної ділянки відновлюється.

серин-протеази

Список серінових протеаз досить довгий. Вони згруповані в дві широкі категорії - 1) ті, які є хімотрипсиноподібними і 2) ті, які є субтилізиноподібними. Хоча ферменти типу субтилізина та хімотрипсину використовують один і той же механізм дії, включаючи каталітичну тріаду, ферменти інакше не пов'язані один з одним послідовністю і, здається, еволюціонували незалежно. Таким чином, вони є прикладом конвергентної еволюції - процесу, коли еволюція різних форм сходяться на структурі, щоб забезпечити спільну функцію.

Ферменти серин-протеази розрізаються поруч зі специфічними амінокислотами, і специфічність визначається розміром/форма/зарядом бічного ланцюга амінокислоти, яка вписується в зв'язуючу кишеню ферменту S1 (рис. 4.62).

Малюнок 4.62 - Субтилізин - серин-протеаза

Приклади серин-протеаз включають трипсин, хімотрипсин, еластазу, субтилізин, сигнальну пептидазу I та нуклеопорин. Серінові протеази беруть участь у багатьох фізіологічних процесах, включаючи згортання крові, травлення, розмноження, імунну відповідь.

Цистеїнові протеази

Цистеїнові протеази (також відомі як тіолові протеази) каталізують розпад білків шляхом розщеплення пептидних зв'язків за допомогою нуклеофільного тіолу з цистеїну (рис. 4.63). Цистеїн зазвичай міститься в каталітичній діаді або тріаді, також залучаючи гістидин і (іноді) аспарагінову кислоту (дуже схожу на серин-протеази). Сульфгідрильна група цистеїнових протеаз більш кисла, ніж гідроксил серінових протеаз, тому аспарагінова кислота тріади потрібна не завжди.

Механізм дії дуже схожий з механізмом серінових протеаз. Зв'язування належного субстрату призводить до активації тіолу (видалення протона групою гістидину). Активований тіол діє як нуклеофіл, атакуючи пептидний зв'язок і викликаючи його розрив. Один пептид вивільняється, а інший пептид стає ковалентно пов'язаним з сіркою. Гідроліз водою виділяє другий пептид і завершує цикл. Приклади цистеїнових протеаз включають папаїн, каспази, білок їжака, кальпаїн та катепсин К.

Малюнок 4.63 - Механізм дії протеаз. У кожному конкретному випадку створюється нуклеофіл - гідроксил (аспартілпротеази), тіол (цистеїнові протеази), і гідроксил (металопротеази). Зображення Алеї Кім

Каспаси

Каспази (цистеїн-аспарагінові протеази) - це сімейство цистеїнових протеаз, які відіграють важливу роль в організмі. На клітинному рівні вони функціонують при апоптозі та некрозі, а в організмі беруть участь у запаленні та імунній системі. Дозрівання лімфоцитів - одна з таких ролей. Однак вони найбільш відомі своєю роллю в апоптозі, що породило описи їх як білки «ката» або «протеази самогубства», які демонтують клітини при запрограмованій загибелі клітин.

Відомо 12 людських каспаз. Ферменти синтезуються у вигляді прокаспазних зимогенів з продоменом та двома іншими субодиницями. Продомен містить області, які дозволяють йому взаємодіяти з іншими молекулами, які регулюють активність ферменту. Каспаси бувають двох форм. Ініціатор caspases при активації активує ефекторні каспази. Ефекторні каспази розщеплюють інші білки в клітці. Мішені для дії розщеплення ефекторної каспази включають ядерні ламіни (волокнисті білки, що забезпечують структурну цілісність ядра), ICAD/DFF45 (інгібітор ДНКАзи), PARP (прапори областей, де необхідний ремонт ДНК) та PAK2 (апоптотична регуляція).

Каскад активації каспази сам по собі може бути активований гранзимом B (серин-протеазою, що секретується природними клітинами кілерами та цитотоксичними Т-клітинами), рецепторами клітинної смерті та апоптосомою (велика білкова структура в апоптотичних клітині, стимульована вивільненням цитохрому С з мітохондрій). Кожен з цих активаторів відповідає за активацію різних груп каспаз.

Металопротеази

Металопротеази (рис. 4.64) - це ферменти, каталітичний механізм розриву пептидних зв'язків яких включає метал. Більшість металопротеаз використовують цинк як свій метал, але деякі використовують кобальт, узгоджений з білком трьома залишками амінокислот з лабільною водою на четвертій позиції. Застосовуються різноманітні бічні ланцюги - гістидин, аспартат, глутамат, аргінін, лізин. Вода є мішенню дії металу, який після зв'язування належного субстрату абстрагує протон для створення нуклеофільної гідроксильної групи, яка атакує пептидний зв'язок, розщеплюючи його (рис. 4.64). Оскільки нуклеофіл тут не прикріплений ковалентно до ферменту, жоден з розщеплених пептидів не закінчується приєднанням до ферменту під час каталітичного процесу. Приклади металопротеаз включають карбоксипептидази, амінопептидази, інсулінази та термолізин.

Малюнок 4.64 - Карбоксипептидаза - металопротеаза

Аспартильні протеази

Як випливає з назви, аспартілпротеази використовують аспарагінову кислоту у своєму каталітичному механізмі (рис. 4.63 та 4.65). Як і металопротеази, аспартілпротеази активують воду для створення нуклеофіла для каталізу (рис. 4.65). Активована вода атакує пептидний зв'язок пов'язаного субстрату і звільняє дві частини без необхідності звільнення пов'язаного проміжного продукту, оскільки вода не ковалентно прикріплена до ферменту. Поширені аспартілпротеази включають пепсин, сигнальну пептидазу II та протеазу ВІЛ-1.

Малюнок 4.65 - Активація аспартілпротеази - аспартат бічний ланцюг реферує протон (верх). Гідроксил атакує пептидний зв'язок (середній). Розбиті шматочки пептиду звільняються (знизу). Зображення Пера Якобсона

треонінові протеази

Хоча треонін має R-групу з гідроксилподібним серином, механізм дії цього класу протеаз дещо відрізняється від серин-протеаз. Є деякі подібності. По-перше, гідроксил треоніну відіграє певну роль у каталізі, а це діяти як нуклеофіл. Нуклеофіл створюється, однак, не каталітичною тріадою, а скоріше в результаті власної α-амінної групи треоніну, абстрагуючої протон.

Через це нуклеофільний треонін в треонінової протеазі повинен знаходитися на n-терміналі ферменту. Нуклеофільна атака пептидного зв'язку в цільовій протеазі призводить до розриву зв'язку, щоб вивільнити один пептид, а інший ковалентно прикріплений до серину, як серин-протеази. Крім того, як і у серінових протеаз, вода повинна надходити, щоб звільнити ковалентно пов'язаний другий пептид, щоб укласти каталітичний механізм.

Приклади

Приклади треонінових протеаз включають каталітичні субодиниці протеасоми. Деякі ацилтрансферази (такі як орнітинацилтрансфераза) еволюціонували той самий каталітичний механізм шляхом конвергентної еволюції. Останні ферменти використовують орнітин замість води для розриву ковалентного зв'язку фермент-субстрат, в результаті чого ацил-група приєднується до орнітину замість води.

Інгібітори протеази

Молекули, які пригнічують каталітичну дію протеаз, відомі як інгібітори протеази. Вони бувають різних форм і мають біологічне та лікарське застосування. Багато біологічні інгібітори самі по собі є білками. Інгібітори протеази можуть діяти декількома способами, в тому числі як інгібітор суїциду, інгібітор перехідного стану, денатуратор і як хелатирующий агент. Деякі працюють тільки на конкретні класи ферментів. Наприклад, більшість відомих аспартільпротеаз інгібуються пепстатином. Металопротеази чутливі до всього, що видаляє метал, необхідний для каталізу. Наприклад, металопротеази, що містять цинк, дуже чутливі до ЕДТА, який хелює іон цинку.

Одна категорія білкових інгібіторів протеази відома як серпіни. Серпіни інгібують серин-протеази, які діють подібно хімотрипсину. 36 з них відомі у людини.

Серпіни незвичні в дії, зв'язуючись з цільовою протеазою необоротно і зазнають конформаційних змін, щоб змінити активний сайт своєї мети. Інші інгібітори протеази виступають як конкурентні інгібітори, які блокують активну ділянку.

Серпіни можуть бути широкими за своєю специфікою. Деякі, наприклад, можуть блокувати активність цистеїнових протеаз. Одним з найвідоміших біологічних серпінів є α-1-антитрипсин (A1AT - рис. 4.66) через його роль в легенях, де він функціонує для інгібування протеази еластази. Дефіцит А1АТ призводить до емфіземи. Це може виникнути в результаті генетичного дефіциту або при курінні сигарет. Реактивні форми кисню, що утворюються при курінні сигарет, можуть окислювати критичний залишок метіоніну (#358 обробленої форми) в A1AT, роблячи його нездатним пригнічувати еластазу. Розгальмована, еластаза може атакувати легеневу тканину і викликати емфізему. Більшість серпінів працюють позаклітинно. У крові, наприклад, серпіни, такі як антитромбін, можуть допомогти регулювати процес згортання.

Малюнок 4.67 - Захворюваність дефіциту α-1-антитрипсину (PiMZ) в Європі у відсотках. Вікіпедія

Антивірусні засоби

Інгібітори протеази використовуються як противірусні засоби для заборони дозрівання вірусних білків - зазвичай білків вірусної оболонки.

Вони входять до складу лікарських «коктейлів», що використовуються для пригнічення поширення ВІЛ в організмі, а також використовуються для лікування інших вірусних інфекцій, включаючи гепатит С. Вони також були досліджені для використання при лікуванні малярії і можуть мати певне застосування в протиракових терапіях, а також.