4.2: Контроль ферментативної активності

Версія для друку цього розділу знаходиться тут: BiochemFFA_4_2.pdf. Весь підручник доступний безкоштовно від авторів за адресою http://biochem.science.oregonstate.edu/content/biochemistry-free-and-easy

Регуляція активності ферментів

Крім своєї здатності сильно прискорювати швидкості хімічних реакцій в клітині, ферменти мають ще одну властивість, яка робить їх цінними. Ця властивість полягає в тому, що їх діяльність можна регулювати, дозволяючи їх активувати і інактивувати, в міру необхідності. Це надзвичайно важливо для підтримки гомеостазу, дозволяючи клітинам реагувати контрольованими способами на зміни як внутрішніх, так і зовнішніх умов.

Пригнічення специфічних ферментів препаратами також може бути корисним з медичної точки зору. Тому розуміння механізмів, що контролюють активність ферментів, має значне значення.

гальмування

Спочатку ми обговоримо чотири типи інгібування ферментів - конкурентне, неконкурентне, неконкурентне та гальмування суїциду. З них перші три типи є оборотними. Останній, гальмування самогубства, не є.

Конкурентне гальмування

Ймовірно, найпростіший тип інгібування ферментів для розуміння - це конкурентне інгібування, і це найбільш часто експлуатується фармацевтично. Молекули, які є конкурентними інгібіторами ферментів, нагадують один з нормальних субстратів ферменту. Прикладом може служити метотрексат, який нагадує фолатний субстрат ферменту дигідрофолатредуктази (DHFR). Цей фермент в нормі каталізує відновлення фолатів, важливу реакцію в метаболізмі нуклеотидів.

Малюнок 4.33 - Конкурентні інгібітори нагадують нормальний субстрат і конкурують за зв'язування на активній ділянці. Зображення Алеї Кім

Інгібітор зв'язування

Коли в препараті присутній метотрексат, частина ферменту DHFR зв'язується з ним, замість фолатів, і протягом часу зв'язування метотрексату фермент неактивний і не в змозі зв'язати фолат. Таким чином, фермент пригнічується. Примітно, що сайт зв'язування на DHFR для метотрексату є активним сайтом, тим самим місцем, яке фолат зазвичай зв'язується. В результаті метотрексат «конкурує» з фолатом за зв'язування з ферментом. Чим більше метотрексату, тим ефективніше він конкурує з фолатом за активну ділянку ферменту. І навпаки, чим більше фолатів, тим менше вплив метотрексат має на фермент, оскільки фолат перевершує його.

Малюнок 4.34 - Метотрексат і дигідрофолат. Зображення Бена Карсона

Не впливає на Vmax

Як ми вивчаємо конкурентне гальмування? Зазвичай це робиться наступним чином. По-перше, виконують набір реакцій V0 проти [S] без інгібітора (20 або близько того пробірки, з буфером та постійною кількістю ферменту, різною кількістю субстрату, рівним часом реакції). Відображено V0 проти [S] (рис. 4.35 червона лінія), а також 1/V0 проти 1/ [S] (рис. 4.36 зелена лінія). Далі проводиться другий набір реакцій таким же чином, як і раніше, за винятком того, що в кожну пробірку додається фіксована кількість інгібітора метотрексату. При низьких концентраціях субстрату метотрексат ефективно конкурує за фермент, але при високих концентраціях субстрату інгібітор матиме значно знижений ефект, так як субстрат перевершує його, завдяки своїй більш високій концентрації (пам'ятайте, що інгібітор знаходиться в фіксованій концентрації).

Рисунок 4.35 V0 vs [S] Графіки для розгальмованих реакцій (червоний) та конкурентно гальмованих реакцій (синій). Обидва в кінцевому рахунку мають однаковий Vmax

Графічно результати цих експериментів з інгібіторами показані на малюнку 4.35 (синя лінія) і малюнку 4.36 (помаранчева лінія). Зверніть увагу, що при високих концентраціях субстрату конкурентний інгібітор по суті не впливає, внаслідок чого фермент залишається незмінним.\(V_{max}\) Повторюємо, це пов'язано з тим, що при високих концентраціях субстрату інгібітор погано конкурує. Однак при менших концентраціях субстрату це відбувається.

Малюнок 4.36 - Ділянки Лайнвівера-Берка - розкуті реакції (зелений колір). Конкурентно гальмуються реакції (помаранчевий). Лінії перетинаються на осі Y на 1/Vmax Оскільки Vmax однаковий для обох реакцій. Зображення Алеї Кім

Збільшений \(K_m\)

У конкурентно пригнічених реакціях очевидний Км ферменту для субстрату збільшується (\(-1/K_m\)наближається до нуля - червона лінія на рис. 4.36), коли інгібітор присутній порівняно з тим, коли інгібітор відсутній, тим самим ілюструючи кращу конкуренцію інгібітора на нижньому субстраті концентрації. Можливо, не очевидно, чому ми називаємо змінений Км очевидним Км ферменту. Причина полягає в тому, що інгібітор насправді не змінює спорідненість ферменту до фолатного субстрату. Здається, це робиться лише. Це пов'язано з тим, як працює конкурентне гальмування. Коли конкурентний інгібітор зв'язує фермент, він ефективно «виводиться з ладу». Неактивні ферменти не мають спорідненості до субстрату і ніякої активності. Ми не можемо виміряти Км для неактивного ферменту.

Молекули ферменту, які не пов'язані метотрексатом, можуть, по суті, зв'язувати фолати і є активними. Метотрексат не впливає на них і їх значення Км незмінні. Чому ж тоді Км виявляється вище при наявності конкурентного інгібітора? Причина полягає в тому, що конкурентний інгібітор має більший ефект зменшення кількості активного ферменту при менших концентраціях субстрату, ніж при більш високих концентраціях субстрату. Коли кількість ферменту зменшується, потрібно мати більше субстрату, щоб забезпечити знижену кількість ферменту, достатню для того, щоб дістатися до Vmax/2.

Варто зазначити, що при конкурентному інгібуванні відсоток неактивного ферменту різко змінюється в діапазоні використовуваних значень [S]. Для початку при низьких значеннях [S] пригнічується найбільший відсоток ферменту. При високих [S] не інгібується значний відсоток ферменту. Це не завжди так, як ми побачимо в неконкурентному гальмуванні.

Неконкурентне гальмування

Другий тип інгібування використовує інгібітори, які не нагадують субстрат і зв'язуються не з активною ділянкою, а скоріше з окремою ділянкою на ферменті (рис. 4.37). Ефект зв'язування неконкурентного інгібітора значно відрізняється від зв'язування конкурентного інгібітора, оскільки немає конкуренції. У разі конкурентного інгібування ефект інгібітора може бути зменшений і врешті-решт переповнений збільшенням кількості субстрату. Це було тому, що збільшення субстрату зробило збільшення відсотків ферменту активним. При неконкурентному гальмуванні збільшення кількості субстрату не впливає на відсоток активного ферменту. Дійсно, при неконкурентному гальмуванні відсоток інгібованого ферменту залишається однаковим у всіх діапазонах [S].

Малюнок 4.37 - Неконкурентне інгібування - інгібітор не нагадує субстрат і зв'язується з ділянкою, відмінною від активної ділянки. Зображення Алеї Кім

Це означає, що неконкурентне інгібування ефективно зменшує кількість ферменту на ту саму фіксовану кількість в типовому експерименті при кожній використовуваній концентрації субстрату Ефект цього інгібування показаний на малюнку 4.38 і 4.39. Як бачите,\(V_{max}\) знижується неконкурентне гальмування в порівнянні з розкутими реакціями.

Малюнок 4.38 - V0 vs [S] ділянки розгальмованих реакцій (червоний) і неконкурентно пригнічених реакцій (синій). Vmax знижується, але значення Км незмінні в неконкурентно гальмованих реакціях

Це має сенс, якщо ми пам'ятаємо, що Vmax залежить від кількості присутнього ферменту. Зменшення кількості присутнього ферменту зменшує\(V_{max}\). При конкурентному гальмуванні це не відбувається виявлено, оскільки при високих концентраціях субстрату є по суті 100% активного ферменту, і,\(V_{max}\) здається, не змінюється. Крім того, Км для неконкурентно гальмованих реакцій не змінюється від реакції розкутих реакцій. Це пояснюється тим, що, як зазначалося раніше, можна вимірювати лише активні ферменти і\(K_m\) є постійною для даного ферменту.\(K_m\)

Малюнок 4.39 - Лайнвівер Берк ділянки розкутих реакцій (зелений) і неконкурентно гальмованих реакцій (фіолетовий). Зображення Алеї Кім

неконкурентне гальмування

Третім типом ферментативного інгібування є неконкурентне гальмування, яке має дивну властивість зниженого Vmax, а також зниженого Км. Пояснення цих, здавалося б, дивних результатів корениться в тому, що неконкурентний інгібітор зв'язується тільки з комплексом фермент-субстрат (ЕС) (рис. 4.40). Інгібіторно-зв'язаний комплекс утворюється переважно при концентраціях високих субстратів, а комплекс ES-I не може вивільнити продукт, поки інгібітор пов'язаний, пояснюючи тим самим знижений\(V_{max}\).

Малюнок 4.40 - Неконкурентне гальмування. Зображення Алеї Кім

Зменшений Км трохи складніше для концептуалізації. Причина в тому, що інгібіторно-зв'язаний комплекс ефективно знижує концентрацію комплексу ЕС. За принципом Ле Шательє відбувається зсув з утворенням додаткового комплексу ES, в результаті чого менше вільного ферменту і більше ферменту у формах ES і ESI (ES з інгібітором). Зниження вільного ферменту відповідає ферменту з більшою спорідненістю до його субстрату. Таким чином, як це не парадоксально, неконкурентне гальмування як зменшується, так\(V_{max}\) і збільшує спорідненість ферменту до його субстрату (\(K_m\)- рис. 4.41 & 4.42).

Малюнок 4.41 - Графік V0 vs [S] для неконкурентного гальмування (синій) та розгальмованих реакцій (червоний)

Малюнок 4.42 - Неконкурентне гальмування (фіолетовий) і розкуті реакції (зелений колір). Зображення Алеї Кім

гальмування самогубств

На відміну від перших трьох типів інгібування, які передбачають оборотне зв'язування інгібітора з ферментом, інгібування суїциду є незворотним, оскільки інгібітор стає ковалентно пов'язаним з ферментом під час інгібування. Інгібування суїциду досить сильно нагадує конкурентне гальмування, оскільки інгібітор, як правило, нагадує субстрат і зв'язується з активною ділянкою ферменту. Основна відмінність полягає в тому, що інгібітор самогубства хімічно реагує в активній ділянці і встановлює з ним зв'язок, що виключає його видалення. Такий механізм полягає в тому, що використовується пеніцилін (рис. 4.43), який ковалентно зв'язується з бактеріальним ферментом, ДД транспептидазою і зупиняє його функціонування. Оскільки нормальною функцією ферменту є створення зв'язку, необхідного для пептидогліканового комплексу бактеріальної клітинної стінки, клітинна стінка не може належним чином сформуватися, а бактерії не можуть розмножуватися.

Малюнок 4.43 - Дія пеніциліну. DD-транспептидаза будує пептидоглікановий шар клітинної стінки бактерій (1-3). Зв'язування пеніциліну DD-транспептидазою зупиняє синтез пептидоглікану (4-5). Вікіпедія

Контроль ферментів

Доречно поговорити в цей момент про механізми використання клітин для контролю ферментів. Існує чотири загальні методи, які використовуються:

1. алостеризм,
2. ковалентна модифікація,
3. доступ до субстрату, і
4. контроль синтезу/розпаду ферментів.

Деякі ферменти контролюються більш ніж одним з цих методів.

Аллостеризм

Термін аллостеризм позначає той факт, що на активність певних ферментів може впливати зв'язування малих молекул. Молекули, що викликають аллостеричні ефекти, бувають двох класифікацій. Ті, які є субстратами для ферментів, на які вони впливають, називаються гомотропними ефекторами, а ті, які не є субстратами, називаються гетеротропними ефекторами.

Гомотропні ефектори зазвичай є активаторами ферментів, з якими вони зв'язуються, і результати їх дії можна побачити при перетворенні гіперболічної кривої, типової для графіка V0 проти [S] для ферменту (рис. 4.18), перетворюючись на сигмоїдальний графік (рис. 4.44). Це пов'язано з перетворенням ферменту з Т-стану в R-стан при зв'язуванні субстрату/гомотропного ефектора.

Малюнок 4.44 - Кінетичний профіль аллостеричного ферменту, активність якого контролюється гомотропним ефектором. Зображення Алеї Кім

Графік V0 проти [S] реакцій аллостеричних ферментів нагадує криву зв'язування кисню гемоглобіну (див. Рис. Незважаючи на те, що гемоглобін не є ферментом і, таким чином, не каталізує реакцію, схожість ділянок не випадкова. В обох випадках вимірюється зв'язування зовнішньої молекули - безпосередньо, на графіку гемоглобіну, і опосередковано за графіком V0 проти [S], оскільки зв'язування субстрату є фактором швидкості реакції ферменту.

Аллостеричне гальмування

Аллостерично регуляція цих ферментів працює шляхом індукування різних фізичних станів (форм як би), які впливають на їх здатність зв'язуватися з субстратом. Коли фермент інгібується шляхом зв'язування ефектора, він перетворюється в Т-стан (T = щільний), він має знижену спорідненість до субстрату і саме через це означає, що реакція сповільнюється.

Аллостерична активація

З іншого боку, коли фермент активується ефекторним зв'язуванням, він перетворюється в R-стан (R = розслаблений) і набагато легше зв'язує субстрат. Коли ефект відсутній, фермент може перебувати в суміші T- і R-станів.

Інгібування зворотного зв'язку

Цікавий вид аллостеричного контролю проявляє ГМГ-КоА-редуктаза, яка каталізує важливу реакцію на шляху, що веде до синтезу холестерину. Зв'язування холестерину з ферментом значно знижує активність ферменту. Холестерин не є субстратом для ферменту, тому він є гетеротропним ефектором.

Примітно, однак, холестерин є кінцевим продуктом шляху, в якому ГМГ-КоА-редуктаза каталізує реакцію. Коли ферменти інгібуються кінцевим продуктом шляху, в якому вони беруть участь, вони, як кажуть, виявляють інгібування зворотного зв'язку.

Інгібування зворотного зв'язку завжди діє алостеризмом і далі, забезпечує важливий і ефективний контроль всього шляху. Інгібуючи ранній фермент на шляху, потік матеріалів (і гідроліз АТФ, необхідний для їх переробки) для всього шляху зупиняється або зменшується, припускаючи, що немає альтернативних методів подачі.

Контроль шляху

У шляху біосинтезу холестерину зупинка цього ферменту має ефект відключення (або принаймні уповільнення) всього шляху. Це важливо, оскільки після каталізу ГМГ-КоА-редуктазою існує понад 20 подальших реакцій, необхідних для отримання холестерину, багато з яких потребують енергії АТФ. Вимкнення однієї реакції зупиняє всі з них. Ще одним чудовим прикладом аллостеричного контролю та інгібування зворотного зв'язку є фермент ATCase, розглянутий нижче.

ATCase

Ще один цікавий приклад аллостеричного контролю та інгібування зворотного зв'язку пов'язаний з ферментом Аспартатат Транскарбамойлаза (ATCase). Цей фермент, який каталізує етап синтезу піримідинових нуклеотидів, має 12 субодиниць. До них відносяться шість однакових каталітичних субодиниць і шість однакових регуляторних субодиниць. Каталітичні субодиниці зв'язуються з субстратом і каталізують реакцію. Регулюючі субодиниці прив'язуються або до СПС, або ОСАГО. Якщо вони зв'язуються з АТФ, ферментні субодиниці влаштовуються в R-стані.

Малюнок 4.45 - Схематична структура ATCase. Регуляторні одиниці = R, каталітичні одиниці = C. Зображення Алея Кім

Р-стан

R-стан ATCase дозволяє субстрату мати більш легкий доступ до шести активних ділянок, і реакція відбувається швидше. При однаковій кількості субстрату фермент в R-стані матиме більшу швидкість, ніж той же фермент, якого немає в R-стані. На відміну від цього, якщо фермент зв'язується з CTP на одній зі своїх регуляторних субодиниць, субодиниці будуть розташовуватися в Т-стані і в такому вигляді субстрат не матиме легкого доступу до активних ділянок, що призводить до більш повільної швидкості для тієї ж концентрації субстрату в порівнянні з R-станом. ATCase цікавий тим, що він також може перевернутися в R-стан, коли один з субстратів (аспартат) зв'язується з активною ділянкою в межах однієї з каталітичних субодиниць.

Аспартат має ефект активізації каталітичної дії ферменту, сприяючи R-стану. Таким чином, аспартат, який є субстратом ферменту, є гомотропним ефектором, а АТФ і CTP, які не є субстратами ферменту, є гетеротропними ефекторами ATCase.

Малюнок 4.46 - Графіки V0 проти [S] для ATCase. Зліва - Аллостеричний ефект аспартату. Праворуч - Аллостеричні ефекти АТФ (активатор) і CTP (інгібітор). Зображення Пера Якобсона

Аллостеричні моделі

Існує три моделі, які зазвичай використовуються для пояснення того, як алостеризм регулює активність ферментів з кількома субодиницями. Вони відомі як

• модель Monod-Wyman-Changeux (MWC) (також відома як узгоджена модель),
• послідовна модель (також відома як KNF),
• і модель морфеїну.

Усі моделі описують стан напруженості (T), який є менш каталітично активним, і стан розслабленого (R), який є більш каталітично активним. Моделі відрізняються тим, як змінюються стани.

Послідовна модель

У послідовній моделі зв'язування аллостеричного ефектора однією субодиницею змушує його переходити зі стану T в R (або навпаки), і ця зміна полегшує аналогічну зміну сусідніх субодиниць. У цій моделі існує причинно-наслідковий зв'язок між зв'язуванням ефектора однією субодиницею та зміною стану суміжною субодиницею.

Наприклад, у гемоглобіні зв'язування одного кисню однією одиницею комплексу може спонукати цю одиницю до R-стану і через взаємодію з іншими субодиницями змусити їх сприяти прийняттю конфігурації R перед тим, як вони зв'язуються з киснем. Таким чином, зв'язування однієї субодиниці сприяє зв'язуванню інших, а кооперативність може бути пояснена зміною спорідненості зв'язування при зміні концентрації кисню.

Малюнок 4.47 - Послідовна модель аллостеричного регулювання. Раунд = R-стан. Квадрат = Т-стан.. Зображення Алеї Кім

Модель MWC

Модель MWC менш інтуїтивно зрозуміла. У ньому весь комплекс змінює стан від T до R (або навпаки) незалежно від зв'язування ефекторів. Переворот між Т-станами і R-станами постулюється бути в рівновазі станів при відсутності ефектора (наприклад, співвідношення T/R 50 до 1, це співвідношення називається L, так L = T/R). Зв'язування ефектора ферментним комплексом має тенденцію до «блокування» комплексу в стані. Зв'язування інгібіторів збільшить співвідношення T/R, тоді як зв'язування активаторів збільшить R і, таким чином, зменшить раціон T/R.

Малюнок 4.48 - Модель MWC - Мультисубодиничний комплекс перевертається в цілому і знаходиться в рівновазі. Вікіпедія

Модель морфеїну

Модель морфеїну схожа на модель MWC, але з додатковим кроком дисоціації субодиниць. Модель MWC пропонує, що переворот між R і T станами відбувається комплексом в цілому і відбувається на всіх одиницях одночасно. Натомість модель морфеїну пропонує, що мультисубодиничний фермент розпадається на окремі одиниці, які потім можуть перевернути структуру та повторно формувати комплекс. У моделі морфеїну в комплексі можуть зібратися лише одиниці однакової форми (наприклад, всі R), пояснюючи тим самим стан «All-R-» або «All-T-», знайдений в моделі MWC.

Велика кількість ферментів, включаючи видатні, такі як цитрат-синтаза, ацетил-КоА-карбоксилаза, глутаматдегідрогеназа, рибонуклеотидредуктаза та лактатдегідрогеназа, мають поведінку, відповідну моделі морфеїну.

Малюнок 4.49 - Морфеїнова модель аллостеризму. Стани перевертаються як мономери і сукупні лише з тим же мономером. Вікіпедія

Ковалентний контроль ферментів

Деякі ферменти синтезуються в абсолютно неактивній формі і їх активація вимагає розщеплення ковалентних зв'язків в них. Такі неактивні форми ферментів називаються зимогенами. Прикладами можуть служити білки, що беруть участь в згортанні крові, і протеолітичні ферменти травної системи, такі як трипсин, хімотрипсин, пепсин та інші.

Синтезування деяких ферментів у неактивній формі має дуже хороший сенс, коли активність ферменту може бути шкідливою для тканини, де він виробляється. Наприклад, хворобливий стан, відомий як панкреатит, виникає, коли травні ферменти, вироблені в підшлунковій залозі, активуються занадто рано і в кінцевому підсумку атакують підшлункову залозу.

Каскади

Як для ферментів згортання крові, так і для травних ферментів зимогени активуються в каскаді протеаз. Це відбувається, коли активація одного ферменту активізує інші в своєрідній ланцюговій реакції. У такій схемі перший фермент, активований протеолітично, розщеплює другий зимоген, викликаючи його активацію, який, в свою чергу, активує третину, і це може протікати через кілька рівнів ферментативної дії (рис. 4.50).

Перевага каскадів полягає в тому, що вони дозволяють досить швидко активізуватися великій кількості зимогенів, так як відбувається посилення сигналу на кожному рівні каталізу.

Зимогени також рясні в крові. Згортання крові передбачає полімеризацію білка, відомого як фібрин. Оскільки випадкове утворення фібрину вкрай небезпечно, оскільки може блокувати потік крові, потенційно викликаючи інфаркт/інсульт, організм синтезує фібрин як зимоген (фібриноген) і його активація виникає в результаті «каскаду» активацій протеаз, що виникають при надходженні сигналу з рани. Аналогічно фермент, що каталізує видалення фібринових згустків (плазмін), також синтезується як зимоген (плазміноген), оскільки випадкове видалення згустків також буде небезпечним (див. Нижче також).

Малюнок 4.50 - схема активації протеази. Вікіпедія

Фосфорилювання/дефосфорилювання

Іншим поширеним механізмом контролю активності ферментів шляхом ковалентної модифікації є фосфорилювання. Фосфорилювання ферментів (на бічних ланцюгах залишків серину, треоніну або тирозину) здійснюється білкокіназами. Ферменти, активовані фосфорилированием, можуть регулюватися додаванням фосфатних груп кіназами або їх видаленням фосфатазами. Таким чином, цей тип ковалентної модифікації легко оборотний, на відміну від протеолітичного розщеплення.

Малюнок 4.51 - Регулювання шляхом ковалентної модифікації ферментів катаболізму глікогену

Зниження/окислення

Цікавий ковалентний контроль ферментів за допомогою відновлення/окислення проявляється у фотосинтетичних рослинам. У світловій фазі фотосинтезу електрони збуджуються світлом і протікають через носії до НАДП+, утворюючи НАДПГ. Таким чином, на світлі концентрація НАДПГ висока. Коли концентрація NADPH висока, концентрація відновленого ферредоксину (молекули, що дарує електрони NADP +) також висока.

Знижений ферредоксин може переносити електрони в тіоредоксин, зменшуючи його. Знижений тіоредоксин може, в свою чергу, переносити електрони білкам для зменшення їх дисульфідних зв'язків. Чотири ферменти, пов'язані з циклом Кальвіна, можуть отримувати електрони з тіоредоксину і активуватися, як наслідок.

До них відносяться седогептулоза 1,7-бісфосфатаза, рибулоза-5-фосфатіназа, фруктоза 1,6-бісфосфатаза і гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназа. Таким чином, у світлі протікають електрони, змушуючи NADPH накопичуватися, а ферредоксин штовхає електрони у напрямку цих ферментів вище, активуючи їх та сприяючи циклу Кальвіна. У темряві падають концентрація зниженого NADPH, зменшеного ферредоксину та зниженого тіоредоксину, що призводить до втрати електронів ферментами циклу Кальвіна (окислення, які повторно утворюють дисульфідні зв'язки) та інактивує цикл Кальвіна.

Інші механізми контролю ферментів

Інші засоби контролю ферментів стосуються доступу до субстрату (контроль рівня субстрату) і контролю синтезу ферментів. Гексокіназа - це фермент, який багато в чому регулюється наявністю її субстрату, глюкози. Коли концентрація глюкози низька, продукт каталізу ферменту - глюкозо-6-фосфат, пригнічує функцію ферменту.

Регуляція ферментів шляхом контролю їх синтезу висвітлюється пізніше в книзі в дискусії, що стосується контролю експресії генів.