5.6: Введення в очищення білка

Успішна процедура очищення білка може бути не що інше, як дивовижна. Якщо ви починаєте з рекомбінантного білка, який виробляється в кишковій паличці, або намагаєтеся виділити білок з якоїсь тваринної або рослинної тканини, ви, як правило, починаєте зі складної суміші білків, нуклеїнових кислот, полісахаридів, ліпідів тощо, з якої вам, можливо, доведеться витягти міліграм (або мікрограм!) кількості потрібного білка, часто з високою чистотою, і, сподіваюся, з високим урожаєм.

Очищення білка можна розглядати як ряд етапів фракціонування, розроблених таким чином, щоб:

• Цікавий білок міститься майже виключно в одній фракції (причому з хорошим врожаєм)
• Значна кількість забруднень можна знайти в різній фракції.

Малюнок 5.6.1: Фракціонування

Першим кроком будь-якого очищення є розробка аналізу на цікавить білок.

Аналіз може бути заснований на деякій унікальній характеристиці білка, що цікавить, можливо, за участю:

• ферментативна активність
• імунологічна активність
• Фізичні характеристики (наприклад, молекулярна маса, спектроскопічні властивості тощо)
• Біологічна активність
• В ідеалі аналіз повинен бути
  • конкретні (ви не хочете помилково позитивний або хибний негативний)
  • швидке (ви не хочете чекати тиждень на результати)
  • чутливий (ви не хочете споживати весь ваш зразок, щоб проаналізувати його)
  • кількісний (потрібен точний спосіб вимірювання кількості вашого білка на кожному етапі очищення)

---

Під час очищення потрібно буде стежити за кількома параметрами, серед яких:

1. Загальний обсяг вашого зразка
2. Загальна кількість білка у вашому зразку

· можна оцінити, використовуючи Е ^1% _{280 нм} = 14,5

· Іншими словами, виміряйте поглинання при 280 нм, розділіть на 1,4, і ви будете мати приблизну концентрацію білка в мг/мл

3. Загальна кількість цікавить білка (той, який ви намагаєтеся очистити). Ця інформація буде визначена з вашого кількісного аналізу

Ця основна інформація дозволить відстежувати наступні параметри під час кожного етапу очищення:

1. % виходу для кожного етапу очищення
2. Питома активність потрібного білка («одиниці активності» бажаного білка/мг загального білка)
3. Покращення очищення кожного етапу (наприклад, «3.5x очищення)

При розробці схеми очищення, як правило, доводиться збалансувати очищення з врожайністю.

• Наприклад, отримати 90% чистого матеріалу з хорошим урожаєм може бути відносно просто.
• Однак може бути важко поліпшити цю чистоту на додаткові кілька процентиль і все ще підтримувати хороший урожай.
• Планове застосування очищеного білка визначає цільову чистоту.
• Якщо білок буде використовуватися для визначення інформації про послідовність амінокислот, можливо, 90% є прийнятним. Однак, якщо матеріал буде використовуватися в клінічних випробуваннях, 99,999+% може бути цільовою чистотою.

Початкові етапи очищення

• Зазвичай (але не завжди) цікавить білок міститься в цитоплазмі клітини (іноді, однак, він може виділятися клітиною в позаклітинне середовище). Таким чином, клітини повинні бути розбиті відкритими, щоб звільнити цитоплазму, процес, відомий як лізис клітин.
• Надзвичайно корисно мати деяку інформацію не тільки про загальні фізико-хімічні характеристики білка, який ви намагаєтеся очистити, але і про забруднюючих компонентах.
• Наприклад, багато білків кишкової палички, як правило, мають низьку молекулярну масу (<50 000 Да) і дещо кислі в ізоелектричній точці

Типовий загальний план процедури очищення білка може виглядати наступним чином:

Малюнок 5.6.2: Етапи очищення білка

Зазвичай на початкових етапах очищення використовуються загальні фізичні та/або хімічні відмінності між розчинними білками та іншими компонентами клітин.

• Наприклад, розчинні білки можна відокремити від загального клітинного сміття та інтактних клітин шляхом центрифугування.
• Таким чином, клітини фізично порушуються (за допомогою гомогенізації або клітинного преса), щоб дозволити звільнення вмісту клітин. Потім слід центрифугування, щоб відокремити загальнорозчинні компоненти від нерозчинних.
• Саме в цей момент починається збір даних для того, щоб стежити за очищенням.

Нуклеїнові кислоти іноді можуть бути легко видалені із зразка шляхом додавання великих катіонних сполук, таких як поліетиленімін або сульфат стрептоміцину.

• Нуклеїнові кислоти зв'язуються з цими сполуками за допомогою електростатичних взаємодій, і комплекс випадає в осад і може бути видалений за допомогою центрифугування.
• Такий же загальний результат можна отримати шляхом змішування в іонообмінних смолах, які є аніонообмінниками (тобто смоли містять катіонні групи), а потім фільтрування або центрифугування для видалення. Як і в будь-якому методі, слід підтвердити, що бажаний білок також не пов'язаний.

Сирі фракції білків можуть бути досягнуті шляхом додавання різних кількостей опадів, таких як сульфат амонію або поліетиленгліколь (ПЕГ).

• Для цього типу етапу очищення проводиться початковий експеримент для контролю частки загального білка, а також бажаного білка, що залишається в розчині (і гранулі) в залежності від концентрації осадителя.

Сульфат амонію (% насиченого)	0	10	20	30	40	50	60	70	80	90
Зразок А 280 (в розчині)	1000	900	600	200	100	75	50	40	25	20
Аналіз активності (одиниці) (у розчині)	200	200	200	190	170	100	30	5	0	0

Малюнок 5.6.3: Концентрація білка та концентрація осадника

Як ми можемо використовувати цю інформацію для використання осадження сульфату амонію як корисного етапу очищення в нашій загальній процедурі очищення?

Почнемо з розрахунку питомої активності (міри чистоти) стартового зразка:

Питома активність = загальні одиниці бажаного білка /мг загального білка

Для розрахунку цих параметрів нам потрібно знати загальний обсяг вибірки (крім інформації в наведеній вище таблиці). При цьому загальний обсяг проби становить 1 л. Знаючи це, і поглинання, ми можемо визначити загальний білок в пробі:

Зразок А ₂₈₀ /1,4» мг/мл зразка

1000/1,4 = 714 мг/мл

714 мг/мл* 1,0 л (1000мл/л) = 714,000 мг загального білка

Білок, що представляє інтерес, був оцінений на 200 одиниць, присутніх у стартовій вибірці. Тому специфічна активність стартового зразка становить:

Питома активність = 200 одиниць/714 000 мг = 2,80 х 10 ^-4 од/мг

Примітка

Примітка: «одиниці» активності залежать від цікавить білка. Це може бути мірою ферментативної активності - тобто 1,0 одиниці ферментативної активності призводить до того, що 1 ммоль субстрату споживається за 1 хв часу.

Тепер ми можемо розширити наведену вище таблицю, щоб включити конкретну активність вибірки.

Сульфат амонію (% насиченого)	0	10	20	30	40	50	60	70	80	90
Зразок А 280 (в розчині)	1000	900	600	200	100	75	50	40	25	20
Загальний мг білка (в розчині)	714 000	643 000	429 000	143 000	71 400	53 600	35 700	28 600	17 900	14 300
Аналіз активності (одиниці) (у розчині)	200	200	200	190	170	100	30	5	0	0
Питома активність (од./мг)	2,80х10 ^-4	3.11х10 ^-4	4,66х10 ^-4	13,3х10 ^-4	23,9х10 ^-4	18,7х10 ^-4	8.40x10 ^-4	1,75х10 ^-4	0	0

Ми можемо побудувати питому активність зразка, що залишився в розчині для різних концентрацій доданого сульфату амонію:

Малюнок 5.6.4: Питома активність та концентрація осадника

• Найвища питома активність спостерігається в розчині при додаванні сульфату амонію до 40% насичення
• Яке збільшення чистоти для зразка 40% розчину?

Очищення = кінцева питома активність/початкова специфічна активність

Очищення = (23,9x10 ^-4 одиниці/мг)/(2,80x10 ^-4 одиниці/мг) = 8,5-кратне очищення

Однак очищення - це не вся історія. Також потрібно враховувати врожайність:

Вихід (%) = (кінцеві загальні одиниці/початкові загальні одиниці виміру) х 100

І ми можемо додати цю інформацію нашу статистику очищення:

Сульфат амонію (% насиченого)	0	10		20	30	40	50	60	70	80	90
Зразок А 280 (в розчині)	1000	900		600	200	100	75	50	40	25	20
Загальний мг білка (в розчині)	714 000	643 000		429 000	143 000	71 400	53 600	35 700	28 600	17 900	14 300
Аналіз активності (одиниці) (у розчині)	200	200		200	190	170	100	30	5	0	0
Питома активність (од./мг)	2,80х10 ^-4	3.11х10 ^-4		4,66х10 ^-4	13,3х10 ^-4	23,9х10 ^-4	18,7х10 ^-4	8.40x10 ^-4	1,75х10 ^-4	0	0
Очищення	Н/Д	1.1	1.7		4.8	8.5	6.7	3.0	0.6	-	-
Вихідність (%)	100	100	100		95	85	50	15	2.5	0	0

Малюнок 5.6.5: Відсоток виходу та концентрації осадів

Інформація про врожайність показує, що наш цікавий білок починає осаджувати близько 30% сульфату амонію. Таким чином, в той час як додавання сульфату амонію до 40% забезпечує найбільшу очистку, це пов'язано з 15% втратою нашого інтересу білка. Інший варіант - додати сульфат амонію до 30%. У цьому випадку ми б реалізували очищення в 4,8 рази, і зазнали збитків всього 5%.

На кожному етапі схеми очищення ми зазвичай стикаємося з рішенням щодо компромісу між чистотою і врожайністю.

• Якщо вихідний матеріал дешевий, рясний або простий у отриманні, ми можемо вибрати наші етапи фракціонування таким чином, щоб максимізувати чистоту за рахунок врожайності
• Якщо вихідний матеріал дорогий, обмежений або важко отримати, ми можемо вибрати максимальний урожай за рахунок чистоти
• Знову ж таки, ці рішення також визначаються цільовим призначенням кінцевого матеріалу, а значить, кінцевою чистотою бажаної.

Таким чином, у вищезгаданому експерименті ми вирішили додати сульфат амонію до концентрації між 20-30%, якщо ми хочемо максимізувати вихід, або, можливо, 40% (або трохи вище), якщо ми хочемо максимізувати очищення.

Практичні питання з етапами фракціонування сульфату амонію

Ми, мабуть, хотіли б видалити сульфат амонію з нашого зразка (можливо, наступна процедура очищення не може переносити буферів високої іонної міцності). Зверніть увагу, що з даних наведеної вище таблиці виглядає так, ніби весь наш цікавий білок випадає в осад, якщо додати сульфат амонію до концентрації 80%. Таким чином, це ми можемо використовувати цю властивість опадів, щоб видалити наш білок з більшої частини сульфату амонію:

1. Додайте сульфат амонію до нашого зразка до концентрації 20-40% насичення (точний відсоток визначається тим, чи хочемо ми максимізувати чистоту або вихід)
2. Центрифуга і викинути гранули
3. Додайте в затриманий розчин сульфат амонію до 80% насичення
4. Центрифугуйте і зберігайте гранули. Ресуспендуйте гранули в буфері, щоб солюбілізувати білок.