4.5: Білково-білкове розпізнавання зондується за допомогою системи активатора транскрипції дріжджів

Last updated
Save as PDF

Page ID: 7511

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Поля, С. і Ок-кю, С.Природа (1989) 340:245-246

Фон

Геном дріжджів містить U перед потоком A активатор S послідовності (UAS)

UAS розташовані 5' до кодуючої області гена і є регуляторними областями - вони пов'язують білки-активатори транскрипції. Ці транскрипційні протеїни-активатори при зв'язуванні з БПК стимулюють транскрипцію (тобто вони можуть містити місця зв'язування РНК-полімерази

Дріжджовий ген, номенклатура білка

Гени дикого типу позначаються великими літерами курсивом (наприклад, GAL4). Мутантні алелі генів позначаються малим курсивом (наприклад, gal4), а закодовані білки позначаються римським типом, з першої літери з великої літери (наприклад, Gal4)

Зростання дріжджів у середовищах, що містять галактозу

Інкубація дріжджів дикого типу в галактозі призводить до збільшення рівня мРНК для ферментів, що беруть участь у метаболізмі галактози, >1,000 разів. Таке підвищення рівня мРНК не спостерігається у мутантів gal4. Білок Gal4 не є одним з ферментів, що беруть участь у метаболізмі галактози, скоріше, це, здається, транскрипційний білок активатора, який спеціально активує транскрипцію генів, що беруть участь у метаболічному шляху галактози. Білок Gal4 зв'язується зі специфічною нуклеотидною довгою областю ДНК 17, розташованою в 5' області генів, що беруть участь у метаболізмі галактози. Ці регіони називаються UAS _GAL Прив'язка Gal4 до UAS _GAL збільшує транскрипцію від сусіднього промоутера

Білок Gal4

Єдиний поліпептидний ланцюг, який містить два домени:

Скріншот (370) .png

Малюнок 4.5.1: Домени білків Gal4

Ці домени функціонально відокремлюються в поліпептидному ланцюжку (рис. 4.5.2). Амінотермінальний (1-74) домен сам по собі може зв'язуватися з послідовностями UAS _GAL, але не може активувати транскрипцію. Карбоксил-термінал (738-881) домен містить активуючу область, але не може активувати транскрипцію, оскільки він не може локалізуватися в регіоні UAS _GAL (тобто поблизу області промоутера)

Скріншот (371) .png

Малюнок 4.5.2: Поліпептидний ланцюг Gal4

Експериментальний дизайн

Уявіть, що у нас є два білки (X і Y), які зазвичай утворюють стабільний комплекс (XY)

Знімок екрана (372) .png

Малюнок 4.5.3: Комплекс

Якщо ми зробимо злитий білок Gal4 (1-74) - X та злитий білок Y -Gal4 (738-881), ми потенційно можемо сформувати функціональний активатор транскрипції Gal4 (тобто область активатора Gal4 в комплексі з областю UAS _GAL.

Знімок екрана (373) .png

Малюнок 4.5.4: Формування активатора транскрипції Gal4

Цей злитий білковий комплекс може виступати в якості функціонального транскрипційного активатора метаболічних ферментів галактози

Знімок екрана (374) .png

Малюнок 4.5.5: Білковий комплекс, що діє як активатор транскрипції

Для перевірки цієї гіпотези автори використовували наступну систему

У білковому комплексі беруть участь два білки SNF1 і SNF4. Білок SNF1 - це серин-треонінова специфічна білкова кіназа, а білок SNF4, як відомо, фізично пов'язаний з SNF1 і має важливе значення для функціонування
Було зроблено 5 різних генних конструкцій за участю Gal4 та SNF1 та SNF4:

Знімок екрана (375) .png

Малюнок 4.5.6: Генні конструкції з Gal4, SNF1, SNF4

Ці генні конструкції були вставлені в дві різні дріжджові плазміди:
- Всі конструкції, що містять амінотермінальні злиття GAL4, були введені в плазміди, що містять ген HIS3 (кодування для біосинтетичного ферменту, необхідного для виробництва амінокислоти гістидину).
- Всі конструкції, що містять карбокситермінальні злиття GAL4, були введені в плазміди, що містять ген LEU2 (кодування біосинтетичного ферменту, необхідного для виробництва амінокислоти лейцину)
Ці плазміди були введені в дріжджі господаря (GGY1: :171), які видалили ген GAL4, ген LACZ видалений, гени HIS3 та LEU2 мутували, щоб бути непродуктивними і які також містили злиття генів GAL1 - LACZ (тобто LaCZ білок, що приводиться з промотора GAL1, який має UAS _GAL. Цей хост, таким чином, D GAL4, D LACZ, his3, leu2, Gal1-LACZ.
Таким чином, селективний тиск для амінотермінальних злиїв GAL4 можна підтримувати шляхом усунення гістидину в середовищі росту (дріжджі спираються на ген HIS3 на плазміду, щоб зробити гістидин)
Так само селективний тиск для карбокситермінальних зливів GAL4 можна підтримувати, усуваючи лейцин у ростових середовищах (дріжджі спираються на ген LEU2 на плазміду, щоб зробити лейцин)
Господар може містити обидва види плазмід (в цьому випадку носіям не вистачало б як гістидину, так і лейцину)
Вираз злиття конструкцій на плазміді фактично регулюється галактозою. Додавання галактози призводить до експресії конструкцій злиття. Однак, оскільки господарем є D GAL4, всі інші гени метаболізму галактози (наприклад, GAL1) не будуть регулюватися у відповідь на додану галактозу.

Наявність функціонального білка Gal4 в дріжджовому господареві GGY1: :171 призведе до наступного:

ВідБУДЕТЬСЯ ЕКСПРЕСІЯ БІЛКА LACZ (що міститься в хості GAL1 - злиття гена LACZ). Таким чином, при наявності субстрату XGAL дріжджова колонія посиніє
Всі гени господаря, які містять UAS _GAL, будуть регулюватися вгору. Це включатиме всі гени дикого типу, що беруть участь у метаболізмі галактози (наприклад, GAL1)

Експериментальні результати

Плазміда	Діяльність LaCZ
1. Жоден	<1
2. ГАЛ 4 (1-881)	4 000
3. ГАЛ 4 (1-147)	<1
4. ГАЛ 4 (1-147) -СНФ1	<1
5. SNF4	<1
6. СНФ 4- ГАЛ 4 (768-881)	<1
7. ГАЛ 4 (1-147) -СНФ1; СНФ 4- ГАЛ4 (768-881)	180
8. ГАЛ 4 (1-147) -СНФ1; СНФ4	7
9. ГАЛ 4 (1-147); СНФ 4- ГАЛ4 (768-881)	<1

Функціональний білок Gal4 призвів до експресії гена GAL1 - LACZ господаря
Коекспресія плазмід, що містять GAL4 (1-147) -SNF1; SNF4- GAL4 (768-881) злиті білки призвела до експресії гену GAL1 - LACZ господаря, що вказує на наявність функціонального білка Gal4 (тобто комплексне утворення злитих білків Gal4)
Однак рівень білка LaCZ був меншим, що свідчить про те, що комплекс синтезу білка SFN1- і SFN4- Gal4 був менш ефективним як активатор транскрипції, ніж білок Gal4 дикого типу.
Спостерігався низький рівень активності білка LaCZ з комплексом білків GAL4 (1-147) -SNF1; SNF4. Це говорить про те, що SNF4 може мати деяку незначну спорідненість до РНК-полімерази.

Висновки

Цей метод може виявитися корисним для ідентифікації білків, які можуть утворювати стабільні комплекси (тобто виявлення специфічних взаємодій білок: білок). Наприклад, якщо ми хочемо знати, які білки зв'язуються з певним рецептором, ми можемо зробити злитий білок рецепторів GAL4 (1-147) і екранувати бібліотеку кДНК для потенційних зв'язуючих білків шляхом побудови конструкцій злиття cDNA- GAL4 (768-881). Потенційні зв'язуючі білки з такої бібліотеки можна просіяти, шукаючи сині колонії з субстратом XGAL, або вибрати для вирощування дріжджів у середовищах з галактозою як джерелом вуглецю.