4.4: SELEX (селективна еволюція лігандів шляхом експоненціального збагачення)
- Page ID
- 7535
Турек і золото, наука (1990) 249:505-510
Геном фага Т4 кодує ДНК-полімеразу (Т4 ДНК-пол)
МРНК для T4 ДНК pol містить послідовність, яка має спорідненість до T4 ДНК pol. Ця послідовність перекриває послідовність Shine/Dalgarno і зв'язування T4 ДНК pol запобігає транскрипції мРНК (і виробляє більше T4 ДНК pol). Таким чином, експресія Т4 ДНК-пол є саморегулюючою (аутогенна регуляція). Будова мРНК в цій області утворює структуру стовбурової петлі
Малюнок 4.4.1: Т4 ДНК-полімераза мРНК
Експериментальна конструкція:
Говорячи простою мовою, генерувати бібліотеку молекул мРНК з випадковою нуклеотидною послідовністю в області петлі. Ця бібліотека матиме розмір 4 8 або 65 536 однозначно різних послідовностей (якщо тільки область циклу рандомізована). Визначте ці послідовності з високою спорідненістю до T4 ДНК pol і визначте їх послідовність.
Шаблон будівництва
Шаблон дуплексної ДНК «синтетичного гена» будується з п'яти праймерів:
Малюнок 4.4.2: Побудова шаблону
- Синтетичний ген становить 110 нуклеотидів в довжину. До його складу входять олігонуклеотиди #3, #4 і #5. Олігонуклеотиди #1 та #2 можна розглядати як «мостові» оліго, які дозволяють лігувати #3, #4 і #5
- Олігонуклеотид #4 містить 5' кінець гена T4 ДНК Pol, що відповідає послідовності мРНК блиску/Далгарно і кроку/петлі зв'язування T4 ДНК pol. Він синтезований, щоб містити випадкові основи у 8-й базовій довгій петльовій структурі домену, що зв'язує ДНК T4.
- Олігонуклеотид #1 містить послідовність для області промотора РНК-полімерази Т7. Транскрипцію можна керувати цим промотором шляхом додавання РНК-полімерази Т7 та рибонуклеотидів.
транскрипція in vitro
- Ген нуклеотидів 110 (дволанцюгова форма ДНК) може транскрибуватися in vitro за допомогою T7 РНК pol
- Транскрипція виробляє 92-нуклеотидну довгу молекулу РНК. Буде бібліотека потенційно з 65 536 унікальних молекул РНК
Малюнок 4.4.3: Транскрипція in vitro
Вибір шляхом зв'язування з Т4 ДНК pol
Ці стенограми РНК з послідовністю, яка надає специфічність зв'язування для T4 ДНК pol вибираються шляхом інкубації бібліотеки РНК з T4 ДНК pol, який був іммобілізований на нітроцелюлозних фільтрах. Фільтри промивають для видалення неспецифічно пов'язаних молекул РНК. Щільно (специфічні) зв'язуючі молекули РНК елююються з білка T4 DNA pol і збираються
Малюнок 4.4.4: Специфічне зв'язування
побудова кДНК
Елюовані молекули РНК перетворюються в однониткову кДНК, використовуючи олігонуклеотид #5 як праймер, і додаючи зворотну транскриптазу та dNTp. Дуплексна ДНК виробляється з однониткової кДНК методом ПЛР з використанням олігонуклеотидів #1 і #5.
Малюнок 4.4.5: Побудова кДНК
Транскрипція in vitro
- Транскрипція in vitro виробляє (меншу) бібліотеку молекул РНК, збагачену для послідовностей з спорідненістю зв'язування для T4 ДНК pol
- процес відбору та збагачення продовжується до отримання колекції послідовностей зв'язування з високою спорідненістю
Експериментальні результати
1. Будівництво бібліотеки
- Оригінальна бібліотека «синтетичного гена» була секвенована масово
- «Сходи» основ у випадковому положенні вказували на те, що бібліотека почала бути більш-менш абсолютно випадковою сукупністю послідовностей у цій області (тобто не було жодного зміщення послідовності в колекції молекул)
2. Зразки з послідовних раундів відбору та посилення були збережені для аналізу секвенування
- Результати показали, що у міру продовження процесу відбору та ампліфікації певні підстави спостерігалися в конкретних положеннях у 8-й базовій мутагенізованій області.
Малюнок 4.4.6: Послідовність мутантів
Послідовність дикого типу може бути знайдена в цій гетерогенній суміші щільних зв'язків послідовностей. 20 клонів з цієї кінцевої бібліотеки були секвеновані.
Малюнок 4.4.7: Суміш щільних послідовностей зв'язування
- Існували, по суті, лише дві різні послідовності: відома послідовність дикого типу та інша інша послідовність (яка змінювалася на чотирьох позиціях)
- Обидва мали схожі характеристики щільного зв'язування (виявлені незначні послідовності виявляли слабше зв'язування)
- Ця альтернативна послідовність може мати іншу структуру петлі стовбура, ніж дикий тип
Малюнок 4.4.8: Зміна структури петлі стебла
Висновки
- Метод SELEX успішно ідентифікував послідовність дикого типу та альтернативну (раніше невідому) послідовність з високою спорідненістю T4 DNA pol зв'язуючими властивостями
- Результати свідчать про те, що послідовність трансляційного оператора дикого типу значною мірою оптимізована для прив'язки (не в змозі покращити далі?)
- Метод SELEX повинен спростити вивчення взаємодій між
- транскрипційні активатори та репресори та транскрипційні комплекси на промоутерних сайтах
- реплікація допоміжних білків і ДНК полюсів біля витоків реплікації
- рибосоми та трансляційні репресори в місцях зв'язування рибосом
- Результати можуть мати відношення до взаємодій, що зв'язують ДНК та білок у певних випадках (тобто якщо взаємодія не включає 2' гідроксильну групу і якщо задіяна структура, яку може прийняти ДНК)
- Замість того, щоб починати з усіх можливих послідовностей, почніть з меншої бібліотеки та об'єднайте реплікацію з полімеразами, схильними до помилок, щоб генерувати додаткові послідовності