Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

4.4: SELEX (селективна еволюція лігандів шляхом експоненціального збагачення)

  • Page ID
    7535
  • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Турек і золото, наука (1990) 249:505-510

    Геном фага Т4 кодує ДНК-полімеразу (Т4 ДНК-пол)

    МРНК для T4 ДНК pol містить послідовність, яка має спорідненість до T4 ДНК pol. Ця послідовність перекриває послідовність Shine/Dalgarno і зв'язування T4 ДНК pol запобігає транскрипції мРНК (і виробляє більше T4 ДНК pol). Таким чином, експресія Т4 ДНК-пол є саморегулюючою (аутогенна регуляція). Будова мРНК в цій області утворює структуру стовбурової петлі

    Знімок екрана (362) .png

    Малюнок 4.4.1: Т4 ДНК-полімераза мРНК

    Експериментальна конструкція:

    Говорячи простою мовою, генерувати бібліотеку молекул мРНК з випадковою нуклеотидною послідовністю в області петлі. Ця бібліотека матиме розмір 4 8 або 65 536 однозначно різних послідовностей (якщо тільки область циклу рандомізована). Визначте ці послідовності з високою спорідненістю до T4 ДНК pol і визначте їх послідовність.

    Шаблон будівництва

    Шаблон дуплексної ДНК «синтетичного гена» будується з п'яти праймерів:

    Знімок екрана (363) .png

    Малюнок 4.4.2: Побудова шаблону

    • Синтетичний ген становить 110 нуклеотидів в довжину. До його складу входять олігонуклеотиди #3, #4 і #5. Олігонуклеотиди #1 та #2 можна розглядати як «мостові» оліго, які дозволяють лігувати #3, #4 і #5
    • Олігонуклеотид #4 містить 5' кінець гена T4 ДНК Pol, що відповідає послідовності мРНК блиску/Далгарно і кроку/петлі зв'язування T4 ДНК pol. Він синтезований, щоб містити випадкові основи у 8-й базовій довгій петльовій структурі домену, що зв'язує ДНК T4.
    • Олігонуклеотид #1 містить послідовність для області промотора РНК-полімерази Т7. Транскрипцію можна керувати цим промотором шляхом додавання РНК-полімерази Т7 та рибонуклеотидів.

    транскрипція in vitro

    • Ген нуклеотидів 110 (дволанцюгова форма ДНК) може транскрибуватися in vitro за допомогою T7 РНК pol
    • Транскрипція виробляє 92-нуклеотидну довгу молекулу РНК. Буде бібліотека потенційно з 65 536 унікальних молекул РНК

    Знімок екрана (364) .png

    Малюнок 4.4.3: Транскрипція in vitro

    Вибір шляхом зв'язування з Т4 ДНК pol

    Ці стенограми РНК з послідовністю, яка надає специфічність зв'язування для T4 ДНК pol вибираються шляхом інкубації бібліотеки РНК з T4 ДНК pol, який був іммобілізований на нітроцелюлозних фільтрах. Фільтри промивають для видалення неспецифічно пов'язаних молекул РНК. Щільно (специфічні) зв'язуючі молекули РНК елююються з білка T4 DNA pol і збираються

    Знімок екрана (365) .png

    Малюнок 4.4.4: Специфічне зв'язування

    побудова кДНК

    Елюовані молекули РНК перетворюються в однониткову кДНК, використовуючи олігонуклеотид #5 як праймер, і додаючи зворотну транскриптазу та dNTp. Дуплексна ДНК виробляється з однониткової кДНК методом ПЛР з використанням олігонуклеотидів #1 і #5.

    Скріншот (366) .png

    Малюнок 4.4.5: Побудова кДНК

    Транскрипція in vitro

    • Транскрипція in vitro виробляє (меншу) бібліотеку молекул РНК, збагачену для послідовностей з спорідненістю зв'язування для T4 ДНК pol
    • процес відбору та збагачення продовжується до отримання колекції послідовностей зв'язування з високою спорідненістю

    Експериментальні результати

    1. Будівництво бібліотеки

    • Оригінальна бібліотека «синтетичного гена» була секвенована масово
    • «Сходи» основ у випадковому положенні вказували на те, що бібліотека почала бути більш-менш абсолютно випадковою сукупністю послідовностей у цій області (тобто не було жодного зміщення послідовності в колекції молекул)

    2. Зразки з послідовних раундів відбору та посилення були збережені для аналізу секвенування

    • Результати показали, що у міру продовження процесу відбору та ампліфікації певні підстави спостерігалися в конкретних положеннях у 8-й базовій мутагенізованій області.

    Знімок екрана (367) .png

    Малюнок 4.4.6: Послідовність мутантів

    Послідовність дикого типу може бути знайдена в цій гетерогенній суміші щільних зв'язків послідовностей. 20 клонів з цієї кінцевої бібліотеки були секвеновані.

    Знімок екрана (368) .png

    Малюнок 4.4.7: Суміш щільних послідовностей зв'язування

    • Існували, по суті, лише дві різні послідовності: відома послідовність дикого типу та інша інша послідовність (яка змінювалася на чотирьох позиціях)
    • Обидва мали схожі характеристики щільного зв'язування (виявлені незначні послідовності виявляли слабше зв'язування)
    • Ця альтернативна послідовність може мати іншу структуру петлі стовбура, ніж дикий тип

    Знімок екрана (369) .png

    Малюнок 4.4.8: Зміна структури петлі стебла

    Висновки

    1. Метод SELEX успішно ідентифікував послідовність дикого типу та альтернативну (раніше невідому) послідовність з високою спорідненістю T4 DNA pol зв'язуючими властивостями
    2. Результати свідчать про те, що послідовність трансляційного оператора дикого типу значною мірою оптимізована для прив'язки (не в змозі покращити далі?)
    3. Метод SELEX повинен спростити вивчення взаємодій між
      • транскрипційні активатори та репресори та транскрипційні комплекси на промоутерних сайтах
      • реплікація допоміжних білків і ДНК полюсів біля витоків реплікації
      • рибосоми та трансляційні репресори в місцях зв'язування рибосом
    4. Результати можуть мати відношення до взаємодій, що зв'язують ДНК та білок у певних випадках (тобто якщо взаємодія не включає 2' гідроксильну групу і якщо задіяна структура, яку може прийняти ДНК)
    5. Замість того, щоб починати з усіх можливих послідовностей, почніть з меншої бібліотеки та об'єднайте реплікацію з полімеразами, схильними до помилок, щоб генерувати додаткові послідовності