Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

1.12: Обмеження дайджест з гелевим електрофорезом

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    6277

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Цілі навчання

    Цілі:

    • Зрозумійте функцію рестрикційних ферментів.
    • Проводять аналіз фрагментів ДНК методом гелевого електрофорезу.

    РЕЗУЛЬТАТИ НАВЧАННЯ СТУДЕНТІВ:

    Після закінчення цієї лабораторії студенти зможуть:

    • Прочитайте плазмідну карту, щоб визначити місця обмеження та розміри фрагментів.
    • Визначте, чи є послідовності розпізнавання рестрикційних ферментів паліндромами.
    • Прогнозуйте розміри фрагментів ДНК, що утворилися після рестрикції дайджесту.
    • Порівняйте смуги електрофорезу гелю для визначення розмірів ДНК.

    Вступ

    Рекомбінантна технологія ДНК можлива завдяки декільком інструментам, корисним для маніпулювання молекулами ДНК та трансформації клітин - включаючи плазміди, рестрикційні ферменти та ДНК-лігазу. Ця лабораторія знайомить вас з плазмідами та рестрикційними ферментами, а також лабораторною технікою гелевого електрофорезу. Пізніше лабораторні експерименти познайомлять вас з іншими інструментами біотехнології.

    Рестрикційні ферменти (також звані рестрикційними ендонуклеазами) - це білки, виготовлені багатьма видами бактерій, для захисту від вірусних інфекцій. Кожен рестрикційний фермент рухається вздовж молекули ДНК, поки не знайде певну послідовність розпізнавання в ДНК. Фермент розрізає дволанцюгову ДНК, в результаті чого утворюються фрагменти ДНК. Виявлено понад 3000 рестрикційних ферментів, які розпізнають короткі (4-8 bp) паліндромні послідовності.

    Це складне зображення, що зображує послідовність розпізнавання для HindiIII і отриманий розріз, зроблений в ДНК.
    Малюнок 1. Послідовність розпізнавання ферменту Хінд

    На малюнку 1 показана послідовність розпізнавання рестрикційного ферменту Hind III. Зверніть увагу, що послідовність розпізнавання є паліндромом, і читає те ж саме відбувається вперед і назад. Фермент Hind III робить шаховий розріз ДНК і виробляє фрагменти, які мають поодинокі багатониткові ділянки, які називаються «липкими кінцями». На малюнку 2 показана послідовність розпізнавання двох інших рестрикційних ферментів Sca 1 і Pst 1. Фермент Pst 1 робить шаховий розріз ДНК при послідовності її розпізнавання. Але рестрикційний фермент Sca I робить тупий розріз у своїй послідовності розпізнавання, щоб генерувати фрагменти ДНК без липких кінців.

    Рестрикційний фермент Sca I має послідовність розпізнавання AGTACT. Робить тупий зріз. Обмеження Pst I вирізає ДНК на CTGCAG і залишає один багатожильний звис на кожному кінці.
    Малюнок 2: Місця розпізнавання рестрикційних ферментів

    Бактеріальні клітини мають всі свої гени (геном) в одній круговій хромосомі. Але бактеріальні клітини також можуть нести несуттєві шматочки ДНК, які називаються плазмідами. Плазміда - це невелика кругова ДНК, яка здатна відтворювати себе, і може переносити кілька генів від клітини до клітини. Вчені здатні розробляти рекомбінантні плазміди для перенесення специфічних генів в клітину-мішень господаря.

    карта, якщо плазміда PuC19 з деякими сайтами обмежень зазначено.
    Малюнок 3: Плазмідна карта PuC19.

    Генетична карта плазміди «PuC19» показана на малюнку 3. Загальний розмір плазміди становить 2686 б.п. Існує сайт розпізнавання Pst I на позиції 439, Hind III сайт розпізнавання на позиції 447, і Sca I сайт розпізнавання в 2179. Якби один рестрикційний фермент використовується для різання плазміди PuC19, що буде вироблено?

    Визначте, які фрагменти ДНК виробляються, коли для розрізання плазмідної ДНК PuC19 використовуються два рестрикційних ферменти.

    Таблиця 1. Прогнозовані фрагменти ДНК з рестрикційного дайджесту плазміди PuC19

    Вирізати з рестрикцією ферментів

    Сканування ІІ та Пост I

    Скат I і Хінд III

    Пост I і Хінді III

    Розміри результуючих фрагментів ДНК

    Частина I: Обмеження дайджест

    Агар - це полісахарид, отриманий з червоних водоростей. Порошок агару спочатку розчиняють в киплячій рідини, а потім охолоджують до утворення студнеобразной твердої матриці. Оскільки мікроби не можуть перетравлювати агар, цей матеріал зазвичай використовується в лабораторіях для зберігання поживних речовин, необхідних бактеріям.

    Матеріали

    • Мікропіпетка П-20
    • Коробка одноразових наконечників для піпеток
    • Чисті мікрофужні трубки
    • Мікрофужна трубка стійки
    • Перманентний маркер
    • Контейнер для відходів для використаних наконечників і мікрофужних трубок
    • Мікрофужні пробірки, що містять:
    • PuC19 плазмідна ДНК
    • Плазмідна ДНК pPuS2
    • Pst 1 Обмеження ферменту
    • Sca 1 Рестрикційний фермент
    • Буфер обмежень
    • Деіонізована вода

    Обладнання

    • Мікроцентрифуга
    • Водяна баня 37 o C (або суха ванна або інкубатор)

    Метод

    1. Використовуйте Шарпі, щоб позначити верхню та бічну частину 3 чистих мікрофужних пробірки A B C та назву вашої групи.
    2. Дотримуйтесь наведеної нижче таблиці реагентів і дозуйте належну кількість реагентів у марковані трубки. Використовуйте нові поради для різних реагентів. Додайте реагенти в розчин на дні трубки. Завжди перевіряйте, чи ваш наконечник піпета порожній після дозування реагенту.

    style="межа: 1px суцільний чорний;»

    Таблиця 2. Обсяги реагентів для додавання до кожної трубки

    Трубка

    ДНК

    Пост 1 RE

    Скан 1 РЕ

    Буфер обмежень

    Вода

    A

    4 мкл Спус2

    2 лип

    		 жоден

    4 лип

    		 жоден

    Б

    4 мкл PuC19

    2 лип

    2 лип

    2 лип

    		 жоден

    C

    4 мкл PuC19

    2 лип

    		 жоден

    4 лип

    		 жоден

    D

    4 мкл PuC19

    		 жоден жоден жоден

    6 лип
    1. Кришка трубки щільно Помістіть дві трубки безпосередньо навпроти один одного в мікроцентрифугу.
    2. Відкручуйте протягом п'яти секунд, щоб довести всі реагенти до дна кожної трубки.
    3. Помістіть трубки в плаваючу стійку на водяній бані 37° C принаймні на одну годину (але не більше двох годин).
    4. Після закінчення інкубаційного періоду ви проаналізуєте вміст за допомогою гелевого електрофорезу в частині IV.

    Частина II: Кастинг агарозного гелю

    Агароза - складний вуглевод, що міститься в морських водоростях. Якщо агарозу розчиняють в киплячій рідині, а потім охолоджують, розчин перетворюється в тверду гелеву матрицю. Розчин агарози буде залитий в ливарний лоток для формування бажаної форми гелю. Гелева гребінець має зубці, які використовуються для формування «колодязів» або отворів для завантаження зразків. Ви будете готувати і відливати 1% агарозний гель з буфером електрофорезу.

    Матеріали

    • Порошок агарози
    • Зважуйте човен
    • Шпатель
    • Малярський скотч
    • 100 градуйований циліндр
    • 250 мл колба Ерленмейера
    • Лоток для лиття гелю для електрофорезу
    • Гелева гребінець
    • Деіонізована або дистильована вода
    • 1X Електрофорез буфер
    • Термостійкі силіконові рукавиці або щипці
    • Електронні або аналітичні ваги
    • Мікрохвильова піч

    Метод

    Примітка
    • Примітка: Якщо у вас концентрований буферний запас електрофорезу, перед приготуванням розчинів агарози або запуском гелевого електрофорезу необхідно розбавити запас до 1X робочої концентрації.
    • Для 20-кратного запасу об'єднайте 25 мл 20X запасу з 475 мл деіонізованої води, щоб зробити 500 мл 1X буфер.
    • Для 50X запасу об'єднайте 10 мл 50X запасу з 490 мл деіонізованої води, щоб зробити 500 мл 1X буфера.
    1. За допомогою градуйованого циліндра виміряйте 100 мл буфера електрофорезу 1X.
    2. За допомогою електронних ваг відміряйте 1,0 г порошку агарози.
    3. Налийте частину виміряного буфера в колбу Ерленмейера 250 мл. Всипте відміряний порошок агарози. Налийте частину виміряного буфера в агарозне зважування човна, і вилийте в колбу. Повторюйте, поки вся агарози не буде перенесена в колбу. Залишок буфера залийте в колбу.
    4. Закрити отвір колби поліетиленовою плівкою. За допомогою наконечника піпетки проткнути невеликий отвір у поліетиленовій плівці.
    5. Помістіть криту колбу в мікрохвильовку і нагрійте на високому вогні. Коли ви побачите бульбашки утворюються в розчині, призупиніть мікрохвильовку, використовуйте рукавиці для духовки, щоб кілька разів акуратно закрутити колбу.
    6. Продовжуйте мікрохвильовку колбу, поки рідина не почне знову пузиритися. Використовуючи рукавиці для духовки, тримайте колбу до світла і закрутіть розчин. Уважно дивіться, щоб перевірити, чи немає цяток або завихрень агарози, підвішеної в рідині. Якщо рідина прозора, то агароза розчиняється. Зачекайте п'ять хвилин, поки агароза охолоне. Примітка: Інструктор оголосить, якщо у вас є система стендів для лиття і не потрібно стрічкою кожен лоток.
    7. Підготуйте акрилові електрофорез гелеві лотки для лиття. Можливо, вам доведеться заклеїти два відкриті кінці кожного лотка. Обов'язково щільно притисніть стрічку по всьому краю лотка нігтем. Якщо використовувати малярський скотч, то можна помітити різницю в напівпрозорості стрічки.
    ливарний лоток зі стрічкою на кінці
    Малюнок 4. Лоток для лиття зі стрічкою
    1. Помістіть гребінець в кожен лоток перед додаванням розчину агарози.
    2. Коли розчин агарози охолоне до такої міри, що ви можете безпечно торкнутися дна колби (~ 60° C; близько п'яти хвилин), залийте розчин агарози в кожен лоток для лиття, щоб розчин покривав близько 2 мм кожної гребінці. Примітка: Для кожного гелю Mini One потрібно 12,5 мл розчину агарози, кожен лоток для лиття вміщує два гелі = 25 мл загалом.
    3. Як тільки гелі застигнуть (що займе близько 30 хвилин), витягніть гребінець з кожного гелю. Витягніть його прямо, не ворушуючи його назад і вперед; це дозволить мінімізувати пошкодження передньої стінки колодязя.

    Частина III: Практика піпетування

    Поки ви чекаєте інкубації рестрикційного дайджесту, ви можете практикувати завантаження зразків у практичний гель. Оскільки агарозні гелі дуже легко проколювати, важливо мати хорошу техніку завантаження зразків. Оскільки гелеві лунки невеликі, лише натисніть мікропіпетку до ПЕРШОЇ зупинки, щоб дозувати зразок. Очищена ДНК виглядає як вода, тому додають кольоровий барвник, щоб переконатися, що ви можете побачити завантаження зразка в свердловину. У завантажувальний барвник додають гліцерин, в'язку рідину, щоб гарантувати, що зразок ДНК опуститься на дно свердловини.

    наконечник піпетки в лунку гелю
    Малюнок 5. Піпетка зразка в лунку гелю агарози

    Матеріали

    • Мікропіпетка П-20
    • Коробка одноразових наконечників для піпеток
    • Контейнер для відходів використовуваних наконечників
    • Трубка кольорового барвника/гліцерину
    • Агарозний або поліуретановий практичний
    • Порошок агарози
    • Зважуйте човен
    • Шпатель
    • Малярський скотч

    Метод

    1. Дивіться відео або демонстрацію інструктора.
    2. Занурте практичний гель водою або буфером.
    3. Практикуйте завантаження 5 мкл і 10 мкл кольорового барвника в кілька лунок практичного гелю. Не міняйте поради для цієї практики.
    4. Щоб закріпити руку піпетки, покладіть лікоть на стіл. Ви також можете використовувати іншу руку, щоб підтримати та закріпити руку піпетки.

    Частина IV: Гелевий електрофорез

    Гелевий електрофорез - це техніка використання електричного струму для відділення суміші молекул, таких як ДНК, РНК та білки. Буфер електрофорезу містить іони для проведення електричного струму. Оскільки молекули ДНК негативно заряджені, вони будуть мігрувати до позитивного електрода (червоного кольору). Затверділа матриця гелю агарози матиме пори різного розміру (схожі на губку), тому розмір, форма і заряд молекул можуть впливати на швидкість переміщення через агарозний гель. Менші молекули рухаються швидше, ніж більші молекули.

    великі молекули поблизу негативного кінця, малі молекули поблизу позитивного кінця
    Малюнок 6. Електрофорез змушує молекули відокремлюватися за розміром в пористому гелі

    ДНК можна візуалізувати за допомогою різних барвників. Вчені зазвичай використовують бромід етидію (або всередині гелю агарози, або як після фарбування після запуску гелю). Оскільки бромід етидію є мутагенним, ми не будемо використовувати це в нашому класі. Замість цього ми будемо використовувати гелеву зелену морилку, яка сумісна з синіми світлодіодними трансіллюмінаторами (наприклад. Міньйон). Альтернативною плямою є гель-червоний колір, який працює з ультрафіолетовими просвітниками.

    Матеріали

    • Порошок агарози
    • Зважуйте човен
    • Шпатель
    • Малярський скотч
    • 100 градуйований циліндр
    • 250 мл колба Ерленмейера
    • Лоток для лиття гелю для електрофорезу
    • Гелева гребінець
    • Деіонізована або дистильована вода
    • 1X Електрофорез буфер
    • Термостійкі силіконові рукавиці або щипці
    • Електронні або аналітичні ваги
    • Мікрохвильова піч

    Метод

    Налаштування зразків ДНК

    1. Знайдіть свої трубки з рестрикційного дайджесту (частина 1).
    2. Додайте 2 мкл гелевого зеленого завантажувального барвника в кожну з пробирок для зразків. Піпет вгору-вниз двічі перемішати рідину.
    3. Помістіть трубки в збалансованій конфігурації в мікроцентрифугу і обертайте протягом п'яти секунд.

    Налаштування системи електрофорезу

    1. Перегляньте демонстраційні або призначені відео та дотримуйтесь інструкцій щодо розміщення лотка для гелю в буферний резервуар для електрофорезу.
    2. Наповніть буферну ємність буфером електрофорезу 1X, гарантуючи, що весь гель повністю занурений. Ви хочете близько 1 мм рідкого шару над гелем, але не надто багато буфера, оскільки це може наростити опір.
    3. Переконайтеся, що гель орієнтований з лунками для зразків, найближчими до негативного електрода (чорного кольору). Переконайтеся, що шнур живлення може легко дістатися. Перевірте, що гелеву коробку не потрібно буде переміщати на 30 хвилин.
    4. Намалюйте і позначте в блокноті, як зразки будуть завантажуватися в гель. Перевірте, чи будете ви ділитися гелем з іншою групою.
    5. Використовуючи новий наконечник для кожного зразка, обережно завантажте зразки ДНК в гелеві лунки.
    6. Після того як всі зразки завантажені, покладіть кришку над коробкою для електрофорезу. [Примітка: Гель зелений особливо чутливий до світла, тому не залишайте світло Mini One увімкненим під час електрофорезу].
    7. Підключіть електричні дроти до джерела живлення. Підключіть обидва висновки до одного каналу, з негативним (-) катодом до катода (чорний до чорного) і позитивний (+) анод до анода (червоний до червоного). [Примітка: Mini One система повинна мати помаранчевий капюшон на місці, щоб увімкнути].
    8. Увімкніть блок живлення і встановіть напругу 130—135 В. [Примітка: системи Mini One не мають регульованої напруги].
    9. Після включення живлення на гелевих коробках шукайте бульбашки, що утворюються на негативному електроді (щоб показати електричний струм) і що барвники рухаються в правильному напрямку. Якщо біг неправильним шляхом, дочекайтеся, поки барвники виявляться всередині гелю агарози, потім поверніть гель 180o і перезапустіть пробіг..
    10. Не можна допускати стікання завантажувального барвника з гелю. Обов'язково вимкніть вимикач живлення і від'єднайте електроди від джерела живлення. Роблять це, захоплюючи електрод у пластикової вилки, А НЕ шнура.
    11. Акуратно зніміть кришку з гелевої коробки і підберіть гелевий лоток. Посуньте гель на поліетиленову плівку поверх відповідного трансілюмінатора. Зробіть фотографію.
    12. Порівняйте розміри драбини ДНК з фрагментами PuC19. Розріз ППСу1 з Пст1 має фрагменти 4100, 2000, 1000, 900, 800, 700 і 500. ППСу2 вирізати з Pst у мене розміри 4100, 1500, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50.
    13. Які розміри мають фрагменти ДНК PuC19?

    РЕЗУЛЬТАТИ

    фото гелю ДНК з смугами, що містять фрагменти ДНК
    Малюнок 7: Обмеження перетравлень після електрофорезу

    Навчальні питання

    1. У природі яка функція рестрикційних ферментів?
    2. Що таке паліндром? Як це пов'язано з рестрикційними ферментами?
    3. Чому лабораторії молекулярної біології завжди мають мікрохвильові печі?
    4. Чому ви ніколи не повинні їсти в лабораторії молекулярної біології?
    5. Як ви видаєте зразки в гель агарози?