6.3: Бактеріальний хемостат
- Page ID
- 32963
Вступ
Біореактори використовуються для вирощування, збору врожаю та підтримки бажаних клітин контрольованим чином. Ці клітини ростуть і розмножуються в присутності відповідного середовища з носіями, що постачають необхідні поживні речовини для росту. Клітини, вирощені в цих біореакторах, збираються для того, щоб ферментативно каталізувати синтез цінних продуктів або змінити існуючу структуру субстрату, роблячи його корисним. Інші біореактори використовуються для вирощування і підтримки різних видів культур тканин. Системи управління технологічними процесами повинні використовуватися для оптимізації випуску продукції, підтримуючи при цьому делікатні умови, необхідні для життя. До них відносяться, але не обмежуючись ними, температура, рівень кисню (для аеробних процесів), рН, витрата субстрату та тиск. Бактеріальний хемостат - це специфічний тип біореактора. Однією з головних переваг хемостату є те, що це безперервний процес (CSTR), тому швидкість росту бактерій може підтримуватися в сталому стані, контролюючи об'ємну швидкість подачі. Бактеріальні хемостати мають безліч застосувань, деякі з яких перераховані нижче.
- Фармацевтичні препарати: Використовується для вивчення ряду різних бактерій, конкретним прикладом є аналіз того, як бактерії реагують на різні антибіотики. Бактерії також використовуються у виробництві терапевтичних білків, таких як інсулін для діабетиків.
- Виробництво: Використовується для виробництва етанолу, бродіння цукру бактеріями відбувається в серії хемостатів. Також в хемостатах виробляється безліч різних антибіотиків.
- Харчова промисловість: Використовується у виробництві ферментованих продуктів, таких як сир.
- Дослідження: Використовується для збору даних, які будуть використовуватися при створенні математичної моделі росту для конкретних клітин або організмів.
Наступні розділи охоплюють інформацію, яка необхідна для оцінки бактеріальних хемостатів.
Бактеріальний Chemostat Дизайн
Бактеріальний хемостат являє собою безперервний змішувально-резервуарний реактор (CSTR), який використовується для безперервного виробництва мікробної біомаси.
Налаштування хіміостату
Установка хемостату складається з стерильного резервуара свіжого поживних речовин, з'єднаного з ростовою камерою або реактором. Свіже середовище, що містить поживні речовини, необхідні для росту клітин, безперервно перекачується в камеру з резервуара середовища. Середовище містить специфічну концентрацію поживних речовин, що обмежують ріст (С), що дозволяє забезпечити максимальну концентрацію клітин всередині ростової камери. Змінюючи концентрацію цього обмежуючого зростання поживної речовини, в свою чергу, змінить сталий стан концентрації клітин (С). Іншим засобом контролю концентрації клітин в стійкому стані є маніпулювання швидкістю, з якою середовище надходить в камеру росту. Середовище капає в культуру через повітряний розрив, щоб запобігти переміщенню бактерій вгору за течією та забрудненню резервуара стерильного середовища.
Добре перемішане вміст судини, що складається з невикористаних поживних речовин, метаболічних відходів, бактерій, видаляється з посудини і контролюється індикатором рівня, щоб підтримувати постійний обсяг рідини в хемостаті. Цей потік стічних вод може контролюватися або насосом, або отвором в бічній частині реактора, що дозволяє видалити надлишок реакційної рідини. У будь-якому випадку потік стоків повинен бути здатний видаляти зайву рідину швидше, ніж потік подачі може подавати нове середовище, щоб запобігти переповненню реактора.
Температура і тиск також повинні контролюватися в межах хемостата, щоб підтримувати оптимальні умови для росту клітин. Використання CSTR з сорочкою для ростової камери дозволяє легко контролювати температуру. Деякі процеси, такі як біологічна ферментація, досить екзотермічні, тому охолоджуюча вода використовується для підтримки температури на її оптимальному рівні. Що стосується тиску в реакторі, то воно контролюється вихідним повітряним потоком, що дозволяє видаляти надлишки газу.
Для аеробних культур очищене повітря барботирует по всьому вмісту судини розпаргатором. Це гарантує, що достатня кількість кисню може розчинятися в реакційному середовищі. Для анаеробних процесів, як правило, немає необхідності у вході повітря, але повинен бути вихід газу, щоб запобігти накопиченню тиску всередині реактора.
Для того, щоб реакційна суміш не стала занадто кислою (дихання клітин призводить до того, що середовище стає кислим) або занадто основним, що може перешкоджати росту клітин, необхідний регулятор рН для того, щоб принести рівновагу рН в систему.
Мішалка гарантує, що вміст посудини добре перемішується. Якщо швидкість перемішування занадто висока, це може пошкодити клітини культури, але якщо вона занадто низька, градієнти можуть накопичитися в системі. Значні градієнти будь-якого виду (температура, рН, концентрація тощо) можуть завдати шкоди виробленню клітин і можуть запобігти досягненню реактора в стабільному режимі роботи.
Ще одне занепокоєння в конструкції реактора - це обростання. Засмічення, як правило, визначається як осадження та накопичення небажаних матеріалів на занурених поверхнях або поверхнях, що контактують з потоком рідини. Коли осаджений матеріал має біологічну природу, його називають біофоулінгом. Обростання або біопалювання в такій системі може спричинити зниження ефективності теплообмінників або зменшення площі поперечного перерізу в трубах. Засмічення на поверхнях теплообмінника призводить до того, що система не працює оптимально, перебуваючи поза цільовим діапазоном температур або витрачаючи надлишок енергії для підтримки оптимальної температури. Засмічення в трубах призводить до збільшення перепаду тиску, що може спричинити ускладнення вниз по лінії. Щоб мінімізувати ці ефекти, промислові реактори хіміостату зазвичай циліндричні, що містять обсяги до 1300 кубічних метрів, і часто виготовляються з нержавіючої сталі. Циліндрична форма і гладка поверхня з нержавіючої сталі дозволяють легко чистити.
Проектування рівнянь
Розрахункові рівняння для реакторів безперервного змішуваного бака (CSTR) застосовні до хемостатів. Залишки повинні бути зроблені як на клітині в культурі, так і на середовищі (субстраті).
Баланс маси
Масовий баланс на мікроорганізмах в CSTR постійного об'єму становить:
[Швидкість накопичення клітин, г/с] = [Швидкість потрапляння клітин, г/с] — [Швидкість виходу клітин, г/с] + [Чиста швидкість генерації живих клітин, г/с]
Баланс маси на підкладці в CSTR постійного об'єму становить:
[Швидкість накопичення субстрату, г/с] = [Швидкість надходження субстрату, г/с] — [Швидкість виходу субстрату, г/с] + [Чиста норма витрати субстрату, г/с]
Припускаючи, що з живильного потоку в реактор не потрапляють клітини, баланс маси клітин може бути перероблений наступним чином:
\[(Rate Accumulation Cells) =V \frac{d C_{C}}{d t} \label{1} \]
\[\text { (Flow Entering) }-(\text {Flow Leaving})=0-\nu_{0} C_{C} \label{2} \]
\[\text{Rate Cell Generation} =V\left(r_{g}-r_{d}\right) \label{3} \]
Аналогічно, баланс маси субстрату може бути перероблений наступним чином:
\[\text{Rate Accumulation Substrate} =V \frac{d C_{S}}{d t} \label{4} \]
\[\text { (Flow Entering) }-(\text {Flow Leaving})=\nu_{0} C_{S 0}-\nu_{0} C_{S} \label{5} \]
\[\text{Rate Substrate Consumption} =V r_{S} \label{6} \]
Складання рівнянь\ ref {1} -\ ref {3} разом дає розрахункове рівняння для клітин в хемостаті:
\[V \frac{d C_{C}}{d t}=0-\nu_{0} C_{C}+V\left(r_{g}-r_{d}\right) \label{7} \]
Аналогічно рівняння\ ref {4} -\ ref {6} разом дає розрахункове рівняння для підкладки в хемостаті:
\[V \frac{d C_{S}}{d t}=\nu_{0} C_{S 0}-\nu_{0} C_{S}+V\left(r_{g}-r_{d}\right) \label{8} \]
Припущення, зроблені щодо CSTR, включають ідеальне перемішування, постійну щільність вмісту реактора, ізотермічні умови та єдину, незворотну реакцію.
Закони про ставки
Багато законів існує для швидкості росту нових клітин.
Рівняння монода
Рівняння Монода є найбільш часто використовуваною моделлю для кривої реакції швидкості росту бактерій.
\[r_{g}=\mu C_{c} \label{9} \]
де
- r g = швидкість росту клітин
- C c = концентрація клітин
- μ = питома швидкість росту
Питома швидкість росту клітин, μ, може бути виражена як
\[\mu=\mu_{\max } \frac{C_{s}}{K_{s}+C_{s}} \label{10} \]
де
- μ max = максимальна питома швидкість реакції росту
- K s = константа Монода
- C s = концентрація субстрату
Рівняння Тессьє та рівняння Мозера
Два додаткових рівняння зазвичай використовуються для опису швидкості росту клітин. Вони є рівняннями Тессьє і Мозера. Ці закони росту використовуватимуться, коли вони краще відповідають експериментальним даними, зокрема на початку або кінці бродіння.
Рівняння Тессьє:
\[r_{g}=\mu_{\max }\left[1-\exp \left(-\frac{C_{s}}{k}\right)\right] C_{c} \label{11} \]
Рівняння Мозера:
\[r_{g}=\frac{\mu_{\max } C_{s}}{1+k C_{s}^{-\lambda}} \label{12} \]
де\(λ\) і\(k\) є емпіричними константами, що визначаються за виміряними даними.
Рівень смертності
Рівень загибелі клітин\(r_d\), враховує природну загибель\(k_d\), і загибель від токсичного побічного продукту\(k_t\), де\(C_t\) знаходиться концентрація токсичного побічного продукту.
\[r_{d}=\left(k_{d}+k_{t} C_{t}\right) C_{c} \label{13} \]
Фаза смерті Фаза загибелі росту клітин бактерій - це зменшення концентрації живих клітин. Це зниження може бути наслідком токсичного побічного продукту, суворих умов або виснаження поживних речовин.
стехіометрія
Для моделювання кількості субстрату та продукту, що споживається/виробляється в наступних рівняннях, використовуються коефіцієнти плинності. Y sc і Y pc - коефіцієнти врожайності для підкладки до клітин і продукту до клітин відповідно. Коефіцієнти врожайності мають одиниці g змінної/g осередків. Рівняння\ ref {14} представляє швидкість виснаження субстрату:
\[-r_{s}=Y_{s c} r_{g}+m C_{c} \label{14} \]
Рівняння\ ref {15} представляє швидкість формування продукту:
\[r_{p}=Y_{p c} r_{g} \label{15} \]
Контрольні фактори
Зростання та виживання бактерій залежать від ретельного моніторингу та контролю багатьох умов у хемостаті, таких як рівень рН, температура, рівень розчиненого кисню, швидкість розведення та швидкість збудження. Як і очікувалося з CSTR, насоси, що подають свіже середовище та видаляють стоки, контролюються таким чином, що обсяг рідини в посудині залишається постійним.
Рівень рН
Різні клітини сприяють різному середовищу pH. Операторам необхідно визначити оптимальний рН і підтримувати CSTR на ньому для ефективної роботи. Контроль рН при бажаному значенні під час процесу надзвичайно важливий, оскільки існує тенденція до зниження рН, пов'язаного з ростом клітин через дихання клітин (вуглекислий газ утворюється, коли клітини дихання, і він утворює вугільну кислоту, яка, в свою чергу, викликає більш низький рН). В екстремальних умовах рН клітини не можуть рости належним чином, тому для відновлення початкового рН потрібно вжити відповідних дій (тобто додавання кислоти або основи).
Температура
Контроль температури також має вирішальне значення, оскільки на ріст клітин можуть значно вплинути умови навколишнього середовища. Вибір відповідної температури може максимізувати швидкість росту клітин, оскільки багато хто з ферментативних активів функціонують найкраще при оптимальній температурі завдяки білковій природі ферментів.
Швидкість розведення
Однією з важливих особливостей хемостата є те, що він дозволяє оператору контролювати швидкість росту клітин. Найпоширенішим способом є контроль швидкості розведення, хоча можуть бути використані інші методи, такі як контроль температури, рН або швидкості передачі кисню. Швидкість розведення просто визначається як об'ємний витрата поживної речовини, що подається в реактор, розділений на обсяг культури (одиниця: час-1). При використанні хіміостата корисно мати на увазі, що питома швидкість росту бактерій дорівнює швидкості розведення в сталому стані. У цьому сталому стані температура, рН, швидкість потоку та концентрація кормового субстрату залишатимуться стабільними. Аналогічно, кількість клітин в реакторі, а також концентрація реагенту і продукту в потоці стоків залишатимуться постійними.
Негативні наслідки можуть виникнути, якщо швидкість розведення перевищує питомий темп зростання. Як видно з Рівняння\ ref {16} нижче, коли швидкість розведення більша за питому швидкість росту (D > μ), термін dC C/dt стає негативним.
\[\frac{d C_{C}}{d t}=(\mu-D) C_{C} \label{16} \]
Це показує, що концентрація клітин в реакторі зменшиться і з часом стане нульовою. Це називається змивом, де клітини вже не можуть утримувати себе в реакторі. Рівняння\ ref {17} представляє швидкість розведення, при якій буде відбуватися змивання.
\[D_{m a x}=\frac{\mu_{m a x} C_{s 0}}{K_{s}+C_{s 0}} \label{17} \]
Загалом, збільшення швидкості розведення збільшить ріст клітин. Однак швидкість розведення все ще потрібно контролювати відносно питомої швидкості росту, щоб запобігти вимиванню. Швидкість розведення повинна регулюватися таким чином, щоб максимізувати швидкість виробництва клітин. На малюнку 1 нижче показано, як швидкість розведення впливає на швидкість вироблення клітин (DC C), концентрацію клітин (C C) та концентрацію субстрату (C S).
Спочатку швидкість вироблення клітин збільшується зі збільшенням швидкості розведення. При досягненні D maxprod швидкість вироблення клітин на максимумі. Це точка, де клітини не будуть рости швидше. D = μ (швидкість розведення = питома швидкість росту) також встановлюється в цій точці, де досягається сталий рівновага. Концентрація клітин (С С) починає знижуватися, коли швидкість розведення перевищує D maxprod. Концентрація клітин буде продовжувати знижуватися, поки не досягне точки, де всі клітини вимиваються. На цьому етапі відбудеться різке збільшення концентрації субстрату, оскільки все менше і менше клітин для споживання субстрату.
Швидкість передачі кисню
Оскільки кисень є важливою поживною речовиною для всього аеробного росту, підтримання достатнього надходження кисню під час аеробних процесів має вирішальне значення. Тому для максимального зростання клітин надзвичайно важливою стає оптимізація перенесення кисню між бульбашками повітря і клітинами. Швидкість перенесення кисню (OTR) говорить нам, скільки кисню витрачається в одиницю часу, коли задані концентрації клітин культивуються в біореакторі. Цей зв'язок виражається в Equation\ ref {18} нижче.
\[\text{Oxygen Transfer Rate (OTR)} = Q_{\ce{O2}}C_C \label{18} \]
Де C C - це просто концентрація клітини в реакторі, а Q O2 - це швидкість мікробного дихання або питома швидкість поглинання кисню. Чемостат є дуже зручним інструментом для вивчення росту конкретних клітин, оскільки дозволяє операторам контролювати кількість кисню, що надходить в реактор. Тому важливо, щоб рівень кисню підтримувався на належному рівні, оскільки ріст клітин може бути серйозно обмежений, якщо надходить недостатній вміст кисню.
Швидкість збудження
Мішалка, зазвичай автоматизована і працює з двигуном, змішує вміст хемостата, щоб забезпечити однорідну суспензію. Це дозволяє окремим клітинам культури вступати в контакт з обмежуючою ростом поживною речовиною та досягти оптимального розподілу кисню при наявності аеробних культур. Швидше, більш суворе перемішування прискорює ріст клітин. Перемішування також може знадобитися для порушення агглютинації бактеріальних клітин, які можуть утворитися.
Q&A
Q1: Чому хемостат називають хемостатом?
A1: Оскільки хімічне середовище є статичним або в стійкому стані. Вважається, що обсяг рідини, концентрація поживних речовин, рН, щільність клітин та інші параметри залишаються постійними протягом всієї роботи судини.
Q2: Які проблеми щодо хемостатів?
A2: а) Піноутворення призводить до переповнення, тому обсяг рідини не буде постійним. б) Зміна швидкості накачування шляхом включення насоса вкл/викл протягом коротких періодів часу може не працювати. Клітини реагують на ці зміни, змінюючи показники. Для правильної реакції потрібен дуже короткий інтервал. c) Тендітні та вразливі клітини можуть бути пошкодженими/розриваються, коли вони потрапляють між магнітним перемішувальним бруском та склом посудини. г) Забруднення бактерій відбувається, оскільки бактерії легко подорожують вгору за течією та забруднюють стерильне середовище. Вирішити це можна, перериваючи шлях рідини з повітряним розривом.
Q3: Рівняння Монода використовує зв'язок Міхаеліса-Ментена, який базується на квазідержавному припущенні. (Т/Ф)
А3: Т
Q4: Важливою особливістю хемостату є швидкість розведення. Визначте швидкість розведення.
A4: Швидкість розведення = обсяг живильного середовища, що подається за годину, розділений на обсяг культури.
Q5: Які переваги/недоліки перед вибором хіміостата замість періодичного реактора для біореакцій?
A5: Переваги: 1. Хімостат має кращу продуктивність, ніж реактор періодичної дії. Існує більш висока норма продукту за раз на обсяг. Пакетний процес витрачає час. Хімостат експлуатується в сталому стані, тому має кращий контроль, підтримуючи однакові умови для всього виробленого продукту.
Недоліки: 1. Хімостат менш гнучкий, ніж реактор періодичної дії. Реактор періодичної дії може бути використаний для виготовлення більше одного продукту. Складніше підтримувати стерильну систему в хемостаті. Реактор періодичної дії легше чистити.
Q6: Яке фізичне значення константи Монода?
A6: Константа Monod - це концентрація субстрату, при якій швидкість росту біомаси мікробних клітин, що беруть участь у реакції, становить половину максимальної швидкості росту.
Дослідники з Мічиганського університету використовують бактеріальний хемостат для моделювання кишкового тракту свині з метою вивчення метаболізму бактерій кишкової палички в цьому конкретному середовищі. Ростова камера хемостата має обсяг 500 дм 3.
Початкова концентрація бактерій кишкової палички, щеплених в ростовій камері хемостату, становить 1 г/дм 3. Підживлення субстрату 100 г/дм 3 подається в хемостат з об'ємною витратою 20 дм 3 /год. Скільки часу потрібно для того, щоб цей біохімічний процес досяг стабільного темпу з моменту запуску? Припустимо, що швидкість росту - рівняння Монода для росту бактерій бактеріальних клітин, показане вище.
Наводяться додаткові дані, що стосуються задачі: μ max = 0,8; K s = 1,7 г/дм 3; Y с/с = 8; Y п/с = 5; m = 0; r d = 0;
Схематичне креслення
Відповідь = 3,7 години
Рішення
Чемостат був змодельований в Excel за допомогою вищезазначених рівнянь проектування та методу Ейлера. Потім було побудовано графік концентрації клітин (г/дм 3) проти часу (hr). Коли концентрація клітин стає стабільною, досягнуто стійкий стан, і час можна зчитувати з графіка. Нижче наведено скріншот моделі та створеного графіка.
Знімок екрана моделі Excel
Графік Excel
Цей графік чітко показує, що сталий стан досягається через 3,7 години після запуску.
Після розрахунку часу, необхідного для досягнення стійкого стану, дослідники приймають рішення про запуск хіміостата. При цьому роблять це, регулюючий клапан для вхідного субстрату подає несправності. Витрата субстрату в хемостат прискорюється при 40 дм 3 /год 2. Визначте, як довго вони повинні виправити проблему до того, як відбудеться вимивання і всі бактерії в хемостаті будуть втрачені.
Схематичне креслення
Моделювання несправності
\[\\frac{d\nu_0}{dt}= kvalve = 40 \nonumber \]
Відповідь = 20 годин
Рішення
Чемостат був змодельований в Excel за допомогою вищезазначених рівнянь проектування та методу Ейлера. Потім було побудовано графік концентрації клітин (г/дм 3) проти часу (hr). Коли концентрація клітин стає нульовою, відбувається вимивання бактерій. Нижче наведено скріншот моделі та створеного графіка.
Знімок екрана моделі Excel
Графік Excel
Цей графік чітко показує, що змивання відбувається через 20 годин після запуску. На прикладі ми бачимо, що управління процесом надзвичайно важливі для бактеріальних хемостатів.
Модель шаблону, що використовується як для розроблених прикладів 1 і 2 можна завантажити тут Медіа: Бактеріальний Chemostat Template.xls
Посилання
- «Чемостат». Словник науково-технічних термінів Макгроу-Хілла. Макгроу-Хілл Компанії, Inc., 2003. Доступ до 16 вересня 2007 року. Доступно http://www.answers.com/topic/chemostat
- Фоглер, Х. Скотт (2006). Елементи інженерії хімічних реакцій. Нью-Джерсі: Прентіс Холл PTR. ІСБН 0-13-047394-4
- Келлі, С. «Ч 9 - Реактори» 17 лютого 2004 року. Отримано 2007-09-24. Доступні www.ecs.syr.edu/факультет/Келлі/роздатки/біохіміка% 20 інженерія/глава% 209% 20reactors.ppt
- Сміт, Г.Л. «Бактеріальний ріст». Отримано 2007-09-15.
- Страндберг, Пер Ерік (2004). «Математичні моделі росту популяції бактерій в біореакторах: формулювання, фазові космічні знімки, оптимізація та контроль». Отримано 2007-09-16.
- Страндберг, Пер Ерік (2003). «Чемостат». Отримано 2007-09-15.
- «Що таке біореактор?» ТОВ «Трансгалактик», 25 травня 2005 р. Отримано 2007-09-24. Доступно http://www.bionewsonline.com/o/what_is_bioreactor.htm
Автори та атрибуція
Автори: Шоко Асей, Брайан Байерс, Олександр Енг, Ніколас Джеймс, Джеффрі Лето
Стюардс: Джеффрі Фалта, Тейлор Лебейс, Шон Мейфілд, Марк Стюарт, Томас Уелч
Стюарди: Сара Хеберт, Валері Лі, Метью Морабіто, Джеймі Полан